选择性吸附髓鞘碱性蛋白抗体的方法建立及效果评价

来源 :首都医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jkenclly
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本研究分为二部分:  第一部分:髓鞘碱性蛋白抗体吸附柱的构建及吸附效率评价  目的:构建脑脊液(Cerebrospinalfluid,CSF)髓鞘碱性蛋白抗体(Myelinbasicproteinantibody,MBP-Ab)免疫吸附柱,通过体外吸附实验观察不同处理方法对MBP-Ab吸附性能的影响。  方法:收集2011年7月-2011年12月天坛医院收治的26例MS患者(符合McDonald2010诊断标准)及11例非MS患者(病毒性脑炎患者7例,急性脊髓炎患者3例,脑脓肿患者1例)的CSF,经离心、分装、-80℃冻存备用。采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测CSF中MBP-Ab的浓度(ng/ml)。选用Dynabeads链霉亲和素磁珠(DynabeadsM-280Streptavidin)与生物素化髓鞘碱性蛋白(Biotin-MBP68-86)肽段结合制备免疫吸附剂。观察不同反应温度、时间、状态、不同缓冲液处理对免疫吸附率(吸附率(%)=(吸附前MBP-Ab浓度-吸附后MBP-Ab浓度)/吸附前MBP-Ab浓度×100%)的影响。  结论:研究表明,DynabeadsM-280Streptavidin作为免疫吸附载体其安全性、有效性、灵敏度、精密度、稳定性、环保性能均较高;液相反应,灵敏、准确、快速,特异性高,重复性好;且操作方法简便易行,这些特点均是将来临床用于脑脊液净化治疗时所要求具备的特性,临床应用的可行性较强。  第二部分:脑脊液置换对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠影响的实验研究  目的:探索脑脊液置换对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)大鼠病情的影响,为未来采用清除CSF中自身抗体方法治疗多发性硬化(Multiplesclerosis,MS)提供实验证据。  方法:采用髓鞘碱性蛋白68-86与弗氏完全佐剂免疫雄性Lewis大鼠建立EAE模型。9只EAE大鼠用于观察发病时间、病情达峰时间及疾病严重程度,以确定后续实验干预的时间点。32只EAE大鼠用于观察EAE大鼠CSF中MBP-Ab的浓度变化规律并确定收集MBP-Ab的时间点。另选30只EAE大鼠随机分为三组,A组:在诱导第8、9、10天经枕大池抽取1OOulCSF后随即注入lOOul生理盐水;B组:在诱导第8、9、10天经枕大池抽取1OOulCSF后随即注回枕大池;C组:自然发病组。每日记录大鼠的临床评分、体重;在免疫后第14天终止实验。终止实验时取腰骶段脊髓行H染色、髓鞘染色研究。通过临床评分及病理学改变评估清除CSF中的MBP-Ab对于EAE病情严重程度的影响。  结果:雄性Lewis大鼠EAE模型发病率为100%,免疫后第9-11天起病,第12-14天为发病高峰期,第15天起病情逐渐恢复,第21天临床症状完全恢复。用ELISA法未检出各时间点EAE大鼠CSF中MBP-Ab的含量。A组、B组的死亡率均为50%。A组、B组、C组在各个时间点的临床评分无显著的统计学差异。A组脊髓组织炎性细胞计数低于C组(A组:36.30±7.51;C组:78.65±9.76,P=0.031),B组和C组脊髓组织炎性细胞计数无显著差异(B组:75.63±8.97;C组:78.65±9.76,P=0.527)。三组大鼠脊髓组织均未见明显的脱髓鞘改变。  结论:脑脊液置换可减轻EAE大鼠脊髓炎性细胞浸润程度,但对其临床评分无显著影响。该方法对大鼠的创伤较大,死亡率高,其确切意义有待进一步研究。
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