松毛虫赤眼蜂共生菌Wolbachia ANK结构域效应蛋白的筛选及特性研究

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节肢动物胞内共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)是目前已知的分布最广、丰度最大的共生细菌类群。参与调控多种宿主生殖表型,包括细胞质不亲和(CI)、雌性化(F)、杀雄(MK)和孤雌生殖(PI),被认为与性别决定和物种形成等进化生物学问题密切相关,在害虫生物防治领域也具有广阔的应用前景。目前,有关二者互作机制的研究多集中于CI方面,对于PI的研究知之甚少。ANK是自然界中常见的介导蛋白质与蛋白质相互作用的序列之一,能够行使多种生物功能,在宿主与微生物相互作用和感染进化中发挥着重要作用。为揭示Wolbachia调控宿主产雌孤雌生殖的分子机制,本研究以感染Wolbachia的松毛虫赤眼蜂为材料,筛选含有ANK结构域的Wolbachia效应蛋白并进行亚细胞定位及表达模式等研究。研究结果如下:1.含有ANK结构域Wolbachia效应蛋白的基因克隆。本研究在诱导松毛虫赤眼蜂PI的Wolbachia基因组中鉴定到40个含有ANK结构域的蛋白基因。通过基因克隆技术鉴定了38个蛋白基因序列。2.含有ANK结构域Wolbachia效应蛋白的诱导表达。成功构建33个重组质粒,通过测定候选效应蛋白表达是否会导致酵母产生强烈的生长抑制来初步判断该蛋白是否为Wolbachia效应蛋白,并通过添加两种压力源(氯化钠和山梨醇)排除部分效应蛋白仅在不利条件下发挥作用的干扰,本研究共得到4个显著影响酵母生长的效应蛋白。3.含有ANK结构域Wolbachia效应蛋白的亚细胞定位。为了初步判断效应蛋白的作用部位,对效应蛋白进行了酵母内的亚细胞定位。结果表明效应蛋白均定位在酵母细胞的细胞核上,因此推测Wolbachia分泌的效应蛋白在宿主细胞的细胞核内发挥作用。4.含有ANK结构域Wolbachia效应蛋白的表达模式分析。利用RT-q PCR技术检测4个含有ANK结构域的效应蛋白在含Wolbachia的松毛虫赤眼蜂不同发育阶段(幼虫、预蛹、蛹、成虫)的表达水平。结果表明4个效应蛋白在不同发育阶段的表达水平均无显著性差异,说明效应蛋白在各时期均稳定表达。效应蛋白的筛选与表达研究是深入了解Wolbachia诱导松毛虫赤眼蜂PI的第一步,本研究为Wolbachia与宿主相互作用机制的探究奠定了一定基础。
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