二甲基疏基丙酸内盐（Dimethysulfoniopropionate,DMSP）是全球重要的有机硫化合物,也是二甲基硫（Dimethylsulfide,DMS）和二甲基亚砜丙酸内盐（Dimethylsulfoxonium propionate,DMSOP）的重要前体物质。DMSP 和 DMS是海洋中重要的营养物质,在全球硫循环、大气化学、信号传递和气候调节等方面都具有非常重要的作用。DMSP作为海洋硫循环中重要的载体物质,每年有约109吨的巨大产量。DMSP的合成者主要包括浮游植物、大型藻类、临海被子植物和多种海洋细菌。由海洋微生物介导的DMSP和DMSOP的合成与分解代谢是全球碳、硫循环的重要步骤。多种海洋细菌以甲硫氨酸（Methionine,Met）作为前体物质合成DMSP,微生物也可以将DMSP裂解为丙烯酸和DMS,也可以氧化DMSP产生DMSOP,并将DMSOP裂解为丙烯酸和二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）。丙烯酸可以作为一种重要的碳源供微生物生长。DMS是一种挥发性气体,可以连接海洋和大气的硫库。DMSO具有重要的生理功能,它可以作为一种有效的生物保护剂、自由基清除剂和细胞内的电解液修饰物。因此研究海洋细菌介导的DMSP和DMSOP的合成与分解代谢对研究微生物驱动全球硫循环的过程具有非常重要的意义。但是,由于缺少结构数据,DMSP合成关键酶和DMSP裂解酶DddK的催化机制尚不清楚。DMSOP作为一种海洋重要有机硫化合物是被何种酶类裂解以及裂解的分子机制也不清楚。本论文中,我们以海洋细菌为研究对象,主要从DMSP合成关键酶MmtN的催化机制、DMSP裂解酶DddK裂解DMSP的分子机制以及DddK裂解DMSOP的分子机制等方面进行了研究。1.海洋细菌合成DMSP途径中关键酶的催化机制过去认为DMSP主要是由海洋浮游植物、大型藻类和临海被子植物等真核生物合成,最近发现多种海洋细菌也可以合成DMSP。DMSP生产者以甲硫氨酸作为起始物质,经过甲基化、转氨基和脱羧基三步重要反应合成DMSP,其中甲基化反应是DMSP合成过程中的最关键步骤。到目前为止,已经报道的参与DMSP合成的关键甲基化酶有4种（DsyB、DSYB、TpMMT和MmtN）,其中,DsyB和MmtN是细菌来源的DMSP合成关键酶,另外两种是真核生物来源的。截至目前,四种DMSP合成关键酶的催化机制都尚不清楚。为了研究DMSP合成关键酶的催化机制,我们以来自海洋细菌Roseovarius indicus B108的DMSP合成关键酶MmtN为研究对象,研究了 MmtN催化Met发生甲基化反应生成S-甲基-甲硫氨酸（S-methyl-methionine,SMM）的分子机制。我们以Escherichia coli BL21（DE3）为表达菌株,异源表达和纯化了 MmtN蛋白,利用高效液相色谱（Highperformance liquid chromatography,HPLC）技术检测了重组MmtN甲基化Met的活性,并研究了 MmtN的基本酶学性质。MmtN甲基化Met的最适酶活温度和最适酶活pH分别是30℃和8.0,对S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl methionine,SAM）和 Met 的 Km 分别为 1.02±0.14 mM 和 1.74±0.18 mM。动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）分析显示,MmtN 在溶液状态下的相对分子质量为101.64 kDa,MmtN的单体分子量为33.06 kDa,证实MmtN在溶液状态下以三聚体形式存在。为了阐明MmtN催化Met甲基化的分子机制,我们解析了野生型MmtN、MmtN和SAM二元复合物以及MmtN和 S-腺苷-L-同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine,SAH）、Met 三元复合物的晶体结构。结构分析表明,MmtN采用依赖SAM甲基转移酶家族典型的扭转开放式折叠方式（Rossman-like fold）,中间由6个平行的β折叠组成,周围被11个α螺旋包围。这个典型的结构中包含一个SAM结合位点和一个Met结合位点,构成反应活性中心。结构与生化分析显示,MmtN在催化Met发生甲基化时,采用邻近-去溶剂化（proximityanddesolvation,PD）机制发生反应,没有氨基酸残基作为催化碱或者催化酸参与反应,反应中心也不存在金属离子。基于结构与突变分析,我们提出了 MmtN催化Met甲基化产生SMM的分子机制。MmtN主要依靠其对Met和SAM的正确定位和定向催化反应的进行。Met被固定在SAM的活性甲基附近（在MmtN-SAH-Met三元复合物的结构中,Met的硫原子和SAH的硫原子之间的距离为4.06 （?））,且Met的硫原子与SAM的活性甲基在同一条直线上,满足SN2亲核取代反应的条件,Met依靠MmtN提供的正确定位及反应微环境,其硫原子带着一对孤对电子攻击SAM的缺电子硫原子,从而将SAM的甲基转到Met的硫原子上,产生SMM。SMM从MmtN的活性中心释放,经过脱羧、氧化和脱氢反应最终合成DMSP。本研究首次揭示了 DMSP合成关键酶催化Met甲基化产生SMM的分子机制,填补了 DMSP合成关键酶在底物的硫原子上实现甲基化的分子机制的空白。2.海洋SAR11细菌类群裂解DMSP产生DMS和丙烯酸的分子机制DMSP在全球硫循环中具有非常重要的作用,很多海洋微生物可以利用DMSP裂解酶裂解DMSP产生活性气体DMS。DMS的氧化产物可以参与形成云凝结核,进而影响全球天气和气候。SAR11细菌类群是含量最为丰富的海洋异养细菌类群,很多SAR11细菌都含有DMSP裂解酶DddK,dddK基因转录产物在海水中含量也相当丰富。为了研究DddK的催化机制,我们以海洋SAR11细菌Pelagibacter ubique HTCC1062来源的DddK蛋白为研究对象,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株,对其进行了异源表达与纯化,在体外检测了重组DddK裂解DMSP产生DMS和丙烯酸的活性,并研究了其基本酶学性质和结构。DddK裂解DMSP反应的最适酶活温度为50℃,最适酶活pH为9.0。在pH 8.0,30℃时 DddK 对 DMSP 的Km为 13.6±2.1 mM,kcat 为 2.1± 0.1 s-1。在 pH 7.0,30℃时DddK对DMSP的Km为3.7±0.6 mM,kcat为0.9± 0.1 s-1。凝胶过滤层析分析显示,DddK在溶液中以二聚体形式存在。我们解析了野生型DddK、DddK突变体Y64A和DddK突变体Y122A与DMSP复合物的晶体结构。结构和突变实验分析显示,Tyr64作为催化碱基发挥功能,Tyr64与DddK活性中心参与金属离子配位的活化水分子形成氢键,DMSP进入活性中心后取代该活化水分子而导致了 Tyr64的去质子化。这与之前报道的Tyr64与金属离子或者His96发生配位的去质子化方式不同。最后,根据我们的突变分析和突变实验结果,我们提出了DddK裂解DMSP产生DMS和丙烯酸的分子机制。系统发育树分析表明,DddW和DddK的亲缘关系较近。序列比对分析表明,我们提出的DddK裂解DMSP的分子机制在海洋含有DddK的SAR11细菌中具有普遍性且DddW可能也采用与DddK类似的催化机制。本研究丰富了我们对SAR11细菌类群裂解DMSP产生DMS和丙烯酸这一重要的生化过程的认识。3.海洋细菌裂解DMSOP产生DMSO和丙烯酸的分子机制DMSOP是最近鉴定的一种有机硫化合物,是海洋硫循环的一个关键代谢产物。同位素分析表明,许多微藻类和海洋细菌利用DMSP合成DMSOP。在海洋环境中,每年都有上百万吨的DMSO产生,这其中很大一部分可能与细菌代谢DMSOP有关。然而,到目前为止,尚未发现可以裂解DMSOP的酶类。因为DMSP和DMSOP有相似的化学结构,所以我们推测DMSP裂解酶也可能裂解DMSOP。为了探究可以代谢DMSOP的酶类和细菌类群,我们以E.coli BL21（DE3）为表达菌株,对来源于P.ubique HTCC1062的DddK蛋白进行了异源表达与纯化,并且检测到了重组DddK裂解DMSOP的活性。我们通过反转录实时定量聚合酶链式反应技术检测了 P.ubique HTCC1062的dddK基因在DMSOP诱导时的转录水平,结果显示该基因上调表达,表明dddK基因很可能在DMSOP代谢过程中发挥功能。随后,我们研究了 DddK裂解DMSOP的基本酶学性质。DddK裂解DMSOP的最适酶活温度为40℃,最适酶活pH为9.0。在pH8.0,30℃时,DddK对 DMSOP 的Km 为 24.1±3.4 mM,kcat 为 14.8±0.9 s-1。DddK 裂解 DMSOP 的Km在毫摩尔量级,说明DMSOP有可能会在细菌体内维持较高的浓度,进而表明了 DMSOP对细菌而言可能具有重要的生理功能。我们进一步的研究发现,除了 DddK,许多其他cupin超家族的DMSP裂解酶（DddQ、DddW和DddY）也具有DMSOP的裂解活性。为了研究细菌裂解DMSOP的分子机制,我们解析了分辨率为1.62 （?）的DddK-DMSOP复合物的晶体结构,并且分析了 DddK结合和催化DMSOP裂解的关键氨基酸残基。DMSOP通过与DddK活性中心的关键氨基酸残基形成氢键、配位键和cation-π相互作用而被锚定在DddK中。基于结构和突变分析,我们提出了 DddK裂解DMSOP产生DMSO的分子机制。DddK的Tyr64作为催化氨基酸残基,催化DMSOP的裂解。由于dddK基因在SAR11细菌中广泛存在,我们的研究结果表明SAR11细菌类群可能是DMSOP的重要代谢类群,此外,cupin超家族DMSP裂解酶所在的多种α、β、γ和δ变形菌纲的细菌也有可能是代谢DMSOP的重要细菌类群。本研究首次发现多种DMSP裂解酶具有裂解DMSOP产生DMSO和丙烯酸的新功能,提出了DddK催化DMSOP裂解的分子机制,并发现包括SAR11细菌在内的多种细菌类群可能是DMSOP潜在的代谢菌群。本章研究结果对更好的认识DMSOP的代谢及其在海洋硫循环中的作用具有重要的意义。综上所述,本论文对DMSP合成关键反应、DMSP裂解产生DMS和丙烯酸以及DMSOP裂解产生DMSO和丙烯酸的分子机制进行了深入研究,研究结果有助于我们更好的认识DMSP的代谢过程和全球碳、硫循环。