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背景及目的： 肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种与多种病因有关的进展性疾病，其病理基础是肺动脉壁的内皮或结构发生改变，致使肺血管内皮功能紊乱及肺血管重构。因此，有效解决内皮功能紊乱及尽早阻止并逆转肺血管重构、扩大血管床横截面积才可能从根本上解决PAH。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是调控血管张力和通透性的重要分子，主要存在于内皮细胞中，是血管壁上一氧化氮(NO)的主要来源，血管内皮细胞产生的NO可通过多途径发挥抗PAH的作用。而位于胞膜窖(Caveolae)的窖蛋白-1(Caveolin-1)是调节eNOS的关键性负性调控因子。主要是位于Caveolin-1的92位苯丙氨酸与eNOS结合而发挥抑制效应，而用丙氨酸(F92A)代替92位苯丙氨酸后获得的突变型F92A-Caveolin-1（F92A-Cav-1、Caveolin-1 mut）不具有抑制eNOS的作用。因此，通过改变基因Caveolin-1对eNOS的负调控作用，可增加eNOS的活性，促进内皮细胞对NO的分泌，从而有利于PAH的治疗。 本研究旨在构建携带eNOS和F92A-Caveolin-1目的基因的慢病毒载体，并对其功能进行检测分析，为下一步的实验研究奠定科研基础。 方法： 1)根据质粒(eNOS、F92A-Cav-1)分别设计引物，并分别在5端和3端加入相应的酶切位点，与慢病毒载体骨架(pLVX-mCMV-mCherry)的酶切位点相同。采用Polymerase chain reaction(PCR)扩增eNOS及F92A-Cav-1目的片段;通过酶切、连接、转化、挑取克隆并筛选阳性克隆，通过PCR鉴定、测序及酶切鉴定等步骤，鉴定正确的阳性克隆质粒命名为: pLVX-eNO S-P2A-F92-Caveolin-1-mCMV-mCherry(LV-eNOS/F92-Cav-1)。2)利用脂质体转染法(Lipofectamine2000)，使用人胚肾细胞（293-T细胞）进行包装，可获得慢病毒Lenti-eNOS/F92-Cav-1，收集感染后48小时及72小时的病毒上清液，采用PEG-it浓缩病毒，采用稀释法测定病毒滴度，并测定293-T细胞的感染指数(multiplicity of infection，MOI)。3)以MOI=1的慢病毒颗粒Lenti-eNOS/F92-Cav-1感染293-T细胞，荧光显微镜下检测感染阳性率。4）鉴定质粒功能，将293-T细胞分三组:①实验组:慢病毒颗粒(Lenti-eNOS/F92-Cav-1)感染组;②阴性对照组:空载体(pLVX-mCMV-mCherry)感染组;③空白对照组(Control组)。实验组按MOI=1感染293-T细胞，应用细胞免疫荧光化学方法检测eNOS蛋白（表达绿色荧光）表达水平，再以DAF-FM DA方法（NO荧光探针法）检测NO生成量。 结果： 1.通过阳性克隆PCR鉴定，测序及酶切鉴定，提示慢病毒表达质粒LV-eNOS/F92-Cav-1构建成功。 2.病毒滴度为2×108TU/ml，慢病毒感染293-T感染指数(MOI)值为1。 3.按MOI=1感染293-T细胞阳性率可达80％以上。 4.与阴性对照组及Control组相比，实验组eNOS蛋白表达水平及NO生成量均升高。 结论： 1.成功构建了携带目的基因eNOS/F92A-Caveolin-1的慢病毒载体Lenti-eNOS/F92-Cav-1。 2.通过对其功能检测，实验组eNOS蛋白表达水平及NO生成量均升高，进一步说明了慢病毒载体Lenti-eNOS/F92-Cav-1构建成功。