解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase(又称RNase Ba)是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种12 kD的胞外小分子RNA酶(Ribonuclease，RNase)。同时在解淀粉芽孢杆菌基因组中含有barnase基因的特异性抑制剂barstar基因，其产物barstar(10 kD)能与barnase以1：1的比例特异性结合，形成高度稳定的复合物，从而使细菌表达的barnase在胞内失去酶活性。Barnase可降解细胞中的RNA，具有强烈的毒性，因此它在特异细胞中的表达将造成细胞的死亡。Barnase催化水解RNA的机制与牛血清RNase A类似，因此，开发微生物来源的RNase Ba，实现其在大肠杆菌中的分泌表达，具有十分重要的意义。 采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略，从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增barnase基因及barstar基因，以pET-22b(+)，pET—32a(+)质粒为载体，依次将barstar基因和barnase基因克隆到其上，并利用重组质粒pLF3上的kil—Km分泌盒构建分泌表达载体pET-22—barstar—barnase—(kil—Km)(简称p22BBK)和pET—32—barstar—barnase—(kil—Km)(简称p32BBK)，实现barnase在大肠杆菌中的分泌表达。IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS—PAGE分析，可检测到12 kD的barnase目的蛋白。 经过优化诱导表达条件，最终得到分泌表达重组质粒p22BBK的最佳诱导条件为：37℃、150 rpm培养至OD600达到0.7(大约3 h后)。在培养基中加入IPTG至终浓度0.5 mM，28℃继续培养5 h，收获细胞。在这个条件下，培养基蛋白可达到的最高酶活为578 u/mL。分泌表达重组质粒p32BBK的最佳诱导条件为：37℃、150 rpm培养至OD600达到0.8(大约3 h后)。在培养基中加入IPTG至终浓度0.25 mM，30℃继续培养5 h，收获细胞。在这个条件下，培养基蛋白可达到的最高酶活为829 u/mL。