论文部分内容阅读
EB病毒感染在儿童期多表现为传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis, IM),部分可演变为严重的嗜血细胞综合症及淋巴瘤。干扰素调节因子3(interferon regulatory factor3, IRF-3)是调节I型干扰素(IFN-a/p)基因表达的关键转录因子,在固有免疫反应和获得性免疫反应中起重要作用。但是EB病毒调控机体干扰素表达以逃避宿主免疫的具体机制尚不十分清楚。本研究通过Real time PCR法检测临床EB病毒感染的IM病人与健康对照组相关因子差异表达,发现IM病人中立即早期蛋白复制与转录激活子(replication and transcription activator, Rta)、miRNA146a、miRNA23a、miRNA24表达显著高于健康对照组,而IRF-3及IFNβ表达显著低于健康对照组。为探索Rta与miRNA是否调控IRF-3及IFNβ表达及相关机制,我们将Rta过表达质粒与含IRF-3启动子区不同片段的萤光素酶报告质粒共转染于HeLa细胞,发现Rta对含-149至-93bp片段的IRF-3启动子重组质粒萤光素酶活性影响较显著。既往研究报道,转录因子E2F1可与IRF-3启动子-149/-93bp区域内E2F1位点结合,抑制IRF-3转录表达。本研究通过E2F1结合位点点突变、过表达E2F1、RNA干扰E2F1表达及染色质免疫沉淀实验证实,在HeLa细胞中Rta可通过上调E2F1表达、增加其与IRF-3启动子区的结合下调IRF-3的表达。通过miRNA过表达及干扰,发现miRNA146a、miRNA23a、miRNA24可下调IRF-3mRNA表达,而miRNA146a可下调IRF-3蛋白表达。我们分别将miRNA146a、 miRNA23a、miRNA24与IRF-3启动子重组萤光素酶报告质粒共转染,发现启动子活性无显著降低,提示上述miRNA并非通过启动子区发挥负性调控作用。进一步实验发现miRNA146a可下调IFNβ信号通路上游分子TRAF6、IRAK1、 NF-κB等表达。通过TRAF6过表达及干扰实验证实,TRAF6在miRNA146a调控IFNβ表达中起重要介导作用。丙戊酸(Valproic acid, VPA)作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂,不同细胞中均可上调IRF-3mRNA及蛋白表达,深入研究发现丙戊酸可通过增加组蛋白H3、H4的乙酰化促进IRF-3转录,增加IRF-3基因表达,而免疫荧光实验进一步证实丙戊酸可明显增加293T细胞核磷酸化IRF-3的表达。本研究发现：Rta可通过上调E2F1表达、增加其与IRF-3启动子区的结合从而抑制IRF-3的表达；miRNA146a通过TRAF6抑制IFNβ转录表达；丙戊酸可通过增加组蛋白乙酰化促进IRF-3的转录表达及磷酸化。本研究拓展了EB病毒逃避宿主免疫机制的探索,完善了EB病毒诱导Rta及miRNA调控IRF-3的分子机制,且为今后临床治疗EB病毒相关疾病提供实验依据。