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目的:明确A型激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,AKAP1)在棕色脂肪细胞线粒体产热中发挥的作用;探讨AKAP1调节棕色脂肪细胞线粒体产热的作用机制;初步探讨AKAP1在高糖高脂环境中表达下调的机制。方法:(1)AKAP1促进棕色脂肪细胞线粒体产热的作用研究:利用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测高脂喂养下AKAP1敲除小鼠和野生型小鼠棕色脂肪组织线粒体的氧耗速率,并通过WB实验对高脂喂养的AKAP1敲除小鼠和野生型小鼠棕色脂肪组织UCP1表达进行检测;通过不同浓度棕榈酸诱导原代棕色脂肪细胞肥大模型,采用油红染色及BODIPY染色实验检测棕榈酸处理下原代棕色脂肪细胞中脂滴的形态变化,并使用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测高浓度棕榈酸处理下AKAP1敲除小鼠和野生型小鼠原代棕色脂肪细胞的氧耗速率。(2)AKAP1促进棕色脂肪细胞线粒体产热的机制研究:利用CO-IP-MS鉴定与AKAP1相互作用的分子,并采用Western blot实验进行验证;利用免疫荧光实验检测AKAP1与ACSL1在线粒体上的定位;采用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测干涉ACSL1对高浓度棕榈酸处理的AKAP1敲除小鼠和野生型小鼠原代棕色脂肪细胞氧耗速率的影响。(3)肥胖可反馈性抑制AKAP1表达的初步机制研究:采用WB及Q-PCR实验对肥胖小鼠不同组织中AKAP1的表达水平进行检测,并验证高浓度的棕榈酸是否影响AKAP1的表达,通过生物信息学方法对影响AKAP1表达的转录因子进行预测,使用WB及Q-PCR实验检测在干涉CEBP-β后野生型小鼠原代棕色脂肪细胞中AKAP1的表达,并利用GEO数据库分析AKAP1与CEBP-β的相关性。结果:(1)研究发现,与野生型小鼠相比,高脂喂养的AKAP1敲除小鼠棕色脂肪组织的线粒体氧耗显著增强(P<0.05),且UCP1表达增多,表明高脂喂养条件下AKAP1敲除小鼠线粒体产热增强。然而,正常饮食条件下,与野生型小鼠相比,AKAP1敲除小鼠UCP1表达水平并未改变,提示AKAP1并不直接影响UCP1表达变化。利用棕榈酸诱导为原代棕色脂肪细胞提供高脂环境,从而构建小鼠原代棕色脂肪细胞肥大模型,发现在高浓度棕榈酸处理后,与野生型小鼠相比,AKAP1敲除小鼠的原代棕色脂肪细胞脂滴含量减少;进一步,发现通过高浓度棕榈酸处理的AKAP1敲除小鼠原代棕色脂肪细胞基础氧耗速率(P<0.01)、解偶联呼吸(P<0.05)和最大氧耗速率(P<0.05)显著增强提示AKAP1可抑制线粒体呼吸功能。(2)利用CO-IP-MS分析发现ACSL1与AKAP1相互作用,且两者均定位在线粒体上。尽管AKAP1敲除并不影响ACSL1的线粒体定位,然而,AKAP1敲除后线粒体ACSL活性显著增强(P<0.05),同时敲除AKAP1可显著降低PKA活性(P<0.05)。下调ACSL1的表达可抑制AKAP1敲除的棕色脂肪细胞线粒体氧耗。(3)在肥胖小鼠的脂肪组织中AKAP1的表达水平较正常小鼠显著降低(P<0.05),同时,在高浓度棕榈酸处理的原代棕色脂肪细胞中,AKAP1的表达水平较对照组显著降低(P<0.05);生物信息学分析预测AKAP1的转录调控因子为CEBP-β。下调棕色脂肪细胞中CEBP-β可显著抑制AKAP1的表达(P<0.05);此外,利用GEO数据库分析发现在人脂肪组织中,AKAP1和CEBP-βmRNA表达水平呈显著正相关(P=0.0025,P=0.0004)。结论:在本研究中,利用棕榈酸诱导构建原代棕色脂肪细胞肥大模型,研究AKAP1在棕色脂肪细胞线粒体功能中发挥的作用,并初步探讨其作用机制。研究发现:(1)高脂条件下AKAP1敲除增强棕色脂肪细胞线粒体氧耗能力。(2)AKAP1可能通过抑制ACSL1活性进而抑制棕色脂肪细胞的线粒体呼吸。(3)高脂状态下小鼠脂肪组织中AKAP1表达降低,其机制可能与转录因子CEBP-β表达正相关。