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目前,糖尿病已成为威胁全人类健康的重要疾病之一。研究证明,移植胰岛是治愈糖尿病重症患者的有效方法,但该医学方法的发展却受到了器官来源不足的制约,而异种移植是解决临床器官移植供体来源短缺的有效途径。在异种器官移植中面临着超急性排斥反应,α-1.3半乳糖苷转移酶基因GGTA1敲除的成功基本上解决了这个问题,然而T细胞的排斥反应仍然是制约异种器官移植发展的一大瓶颈。LEA29Y是一种能够高效抑制T细胞活性的新型融合蛋白,该蛋白的广泛性表达容易导致转基因动物免疫力低下而不易存活,因此,制备胰岛特异性表达LEA29Y的GGTA1基因敲除(GTKO)猪对于解决异种胰岛移植的排斥反应具有重大意义。本研究利用猪胰岛素启动子(porcine insulin promoter,PIP)和牛生长激素poly A (bGHpA),构建胰岛β细胞特异性表达LEA29Y载体,同时利用TALENs诱导的NHEJ对GGTA1基因进行敲除,得到了如下结果：1、利用PIP(包括猪胰岛素基因第1外显子和第1内含子)和bGHpA构建表达框,考虑到酶切位点插入不同位置可能对启动子效率造成影响,构建了3种表达载体。通过实验分析比较,发现将PIP的内含子拼接位点突变为HindⅢ内切酶识别位点后,第1内含子不剪切,但是可以介导下游基因稳定高效地表达,可以作为后续试验中胰岛特异表达目的基因的理想表达框。2、用1.2kb的LEA29Y基因取代胰岛p细胞特异表达框中EGFP基因序列,体外转染MIN-6小鼠胰岛细胞和猪耳成纤维细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测发现LEA29Y只特异地在β细胞中表达,与预期结果一致,表明该载体可以用于后续的细胞转染和筛选,为制备胰岛特异表达LEA29Y转基因猪奠定了基础。3、根据五指山小型猪基因组序列设计敲除GGTA1基因的TALEN质粒,与胰岛特异性表达LEA29Y基因的质粒共转五指山小型猪耳成纤维细胞,筛选获得理想的GTKO/LEA29Y单细胞克隆,通过体细胞核移植获得GTKO/LEA29Y阳性胚胎,胚胎移植后期待获得GTKO/LEA29Y转基因阳性猪,为解决异种移植中的超急性排斥反应和T细胞排斥反应奠定了基础。