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口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、烈性传染病,严重影响全球养殖业发展。疫苗免疫是防控FMD的常见手段,但是传统灭活疫苗在制备过程中部分抗原成分易被破坏,且免疫维持期短。因此,研制高效的FMD新型疫苗是当前的热点。VP1是FMDV的主要结构蛋白,已有数据证实该蛋白在诱导机体产生免疫应答中起关键性作用,是研制FMD亚单位疫苗的首选蛋白。本研究根据我国FMD的流行特点,以猪O型FMDV VP1基因序列为基础,重复串联优势T、B细胞表位基因,设计合成重组基因RP1,以期在CHO-K1细胞中表达FMDV抗原表位融合VP1的高免疫原性抗原蛋白RP1,为FMD新型疫苗的研制奠定基础。本研究将重组RP1基因克隆到表达载体p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro中,经PCR、双酶切和基因序列测定后,获得重组质粒p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。将该重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染HEK-293T细胞,获得重组病毒HIV-RP1。将重组病毒感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得可表达融合蛋白RP1的重组细胞CHO-K1-RP1。为鉴定重组细胞中RP1基因的表达情况,本研究分别进行了RT-PCR和间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）检测。RT-PCR结果显示,在约1 500 bp处能观察到清晰的单一条带,与预期目的片段大小相符;IFA结果显示,荧光显微镜下可观察到重组细胞CHO-K1-RP1发出绿色荧光。结果表明,RP1基因成功整合到CHO-K1细胞的基因组中,获得了可表达融合蛋白RP1的重组细胞CHO-K1-RP1。为获得能稳定高效表达融合蛋白RP1的CHO-K1-RP1单克隆细胞株,本研究经有限稀释法筛选获得了多个单克隆细胞株,通过IFA、Western blot和q RT-PCR对获得的细胞株进行检测,分析RP1基因在各细胞株中的表达情况。IFA结果显示,部分细胞株在荧光显微镜下能观察到绿色荧光;Western blot结果显示,部分细胞样品在约55 k Da处能观察到清晰的条带,与预期蛋白分子量相符;q RT-PCR结果显示,成功从IFA和Western blot鉴定阳性的细胞株基因组中扩增出RP1基因。结果表明,筛选的51号CHO-K1-RP1单克隆细胞株可高效表达融合蛋白RP1。将筛选获得的51号单克隆细胞株连续传至第30代,每隔5代收取相同数量的细胞进行变性处理,用FMDV VP1单克隆抗体对细胞样品进行Western blot检测,分析RP1基因在CHO-K1-RP1细胞株中的稳定表达情况。结果显示,经检测的第5代、10代、15代、20代、25代和30代细胞样品均能在约55 k Da处观察到特异性条带,与预期蛋白分子量相符。结果表明,RP1基因已经稳定整合到CHO-K1的基因组中,各代次细胞表达产物均具有较好的抗原性。为大量获得融合蛋白RP1,本研究对筛选的51号细胞株进行悬浮训化,收集悬浮培养物经变性处理后进行Western blot检测,使用Image J软件对融合蛋白RP1进行半定量分析。结果显示,筛选获得的51号细胞株能适应低血清培养基在摇瓶中正常生长,悬浮培养物中融合蛋白RP1浓度达110μg/m L。为研究白细胞介素（Interleukin,IL）对融合蛋白RP1的免疫影响,本研究采用RT-PCR技术从猪淋巴细胞中扩增获得猪IL-4基因,并克隆到表达载体pc DNA3.1中,经PCR、双酶切和基因序列测定后,获得重组质粒pc DNA3.1-IL-4。本研究将获得的融合蛋白RP1与ISA 201VG佐剂等体积混合制成油乳剂疫苗,免疫BALB/c小鼠对RP1进行免疫原性分析,并设置了FMD亚单位疫苗与不同免疫刺激物的联合免疫组。实验分组如下:I组接种FMD亚单位疫苗,II组接种FMD亚单位疫苗+CD154,III组接种FMD亚单位疫苗+pc DNA3.1-IL-4,IV组接种FMD亚单位疫苗+新型核酸佐剂（Nucleic acid adjuvant,NAA）NAA,V组接种FMD商品化灭活疫苗,VI组接种PBS。采用皮下多点注射的方式接种,所有实验鼠均免疫3次,每次免疫间隔2周。分别在每次免疫后7 d采用断尾的方式收集血清,通过间接ELISA技术测定小鼠血清样品中特异性抗体水平。结果显示,本研究制备的FMD亚单位疫苗在第二次免疫后可诱导小鼠机体产生特异性抗体;除PBS组,各实验组小鼠血清中FMDV抗体在加强免疫后均有一定提升,其中FMD亚单位疫苗+NAA组血清样品中FMDV抗体变化较明显,显著高于FMD商品化灭活疫苗组（p＜0.05）;FMD亚单位疫苗组、FMD亚单位疫苗+CD154组、FMD亚单位疫苗+pc DNA3.1-IL-4组与FMD商品化灭活疫苗组间抗体水平无显著差异（p＞0.05）。结果表明,本研究获得的融合蛋白RP1具有较好的免疫原性,与NAA联合使用可诱导产生高水平免疫应答。综上,本研究筛选获得了能稳定高效表达FMDV抗原表位融合VP1（融合蛋白RP1）的CHO-K1-RP1悬浮细胞株,其表达产物具有较好的免疫原性,有望成为FMD亚单位疫苗研制的候选蛋白。