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趋化因子是一组有趋化功能的可溶性细胞因子,通常由70-90个氨基酸组成。通过与细胞膜上相应的G蛋白耦联受体结合,趋化因子在淋巴细胞的募集和活化等免疫反应过程中发挥着重要作用。到目前为止,在人体已经发现了大约50种趋化因子以及相应的约18种趋化因子受体。依据其结构中半胱氨酸残基位点的不同,趋化因子被分为CXCL、CCL、C和CX3C四大亚家族。趋化因子CCL24属于嗜酸性粒细胞选择性趋化和激活因子eotaxins类分子,也被称为eotaxin2或MPIF-2(myeloid progenitor inhibitory factor2)。CCL24与唯一受体CCR3结合后,在人体广泛参与过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病等多种免疫相关疾病的发病过程。既往研究表明,人早孕期母胎界面存在eotaxins家族的eotaxin1/CCL11分子,并且高表达eotaxins类分子的共同受体CCR3。因此,我们推测:人早孕期母胎界面表达有趋化因子CCL24,CCL24与受体CCR3结合可能参与子宫内膜蜕膜化、胚胎种植以及母胎免疫耐过程的形成,并发挥一定的调节作用。本课题围绕母胎界面局部CCL24和CCR3的表达和功能调节进行试验设计,以探讨趋化因子CCL24和受体CCR3在母胎界面的表达特征及生物学意义。 第一部分CCL24对人早孕期滋养细胞自分泌调节作用 目的: 测定CCL24及其受体CCR3在人早孕期绒毛滋养细胞(Tros,trophoblasts)上的分子表达水平,并探讨CCL24/CCR3对滋养细胞的自分泌调节作用。 方法: 分离、培养并鉴定人早孕期母胎界面Tros。免疫组织化学(IHC,Immunohistochemistry)、酶联免疫吸附试验(ELISA,Enzyme-linkedimmunosorbent assay)及流式细胞术(FCM,flow cytometry)测定滋养细胞分泌或表达CCL24/CCR3的水平。将蜕膜基质细胞(DSCs,decidual stromal cells)与Tros细胞共培养48 h,检测Tros分泌CCL24以及表达CCR3水平的变化。在体外,rhCCL24处理Tros48 h后,BrdU增殖实验检测Tros细胞增殖情况,MTT比色法检测Tros细胞活力,侵袭实验了解Tros细胞侵袭力的变化。 结果: 本实验室建立的滋养细胞原代培养方法,可得到CK7+ Tros细胞纯度达85%。IHC结果显示,绒毛组织表达中等水平的CCL24,并高表达CCR3受体。ELISA检测Tros细胞体外培养24-96 h不同时段的上清,我们发现Tros细胞上清中存在CCL24蛋白,其含量随时间增加而降低。FCM检测Tros细胞膜上CCR3表达水平为(10.79±0.82)%。等比例DSCs与Tros共培养48 h后,CK7+ Tros占总细胞数的(21.33±4.21)%。共培养上清中CCL24分泌的水平增加,结果有显著差异。共培养后,Tros细胞表面的CCR3表达水平也明显增加,至(57.15±11.27)%。在体外,rhCCL24促进Tros细胞的增殖和细胞活力,并以1 ng/ml效果最明显。另外,rhCCL24呈剂量依赖性抑制Tros的侵袭能力,高浓度时抑制作用最显著。 结论: 本课题的原代滋养细胞培养方法能得到较高纯度的Tros细胞。人早孕期母胎界面的Tros细胞可分泌趋化因子CCL24,并表达其受体CCR3,提示在母胎界面CCL24/CCR3可能通过自分泌方式调解自身的生物学功能,从而参与胚胎种植和胎盘形成过程。Tros与DSCs共培养,可模拟母胎界面Tros与DSCs直接接触状态。共培养系统中CCL24的分泌水平增加,DSCs能促进Tros细胞膜上CCR3的表达。CCL24促进Tros细胞增殖和细胞活力,利于胚胎种植和胎盘形成。同时,CCL24又抑制Tros细胞侵袭能力,控制滋养细胞侵入过度引起滋养细胞相关疾病。因此,CCL24在胚胎种植过程中可调控滋养细胞侵入蜕膜的程度,从而发挥双向调节作用。 第二部分滋养细胞来源的CCL24对蜕膜基质细胞旁分泌调节作用 目的: 测定CCL24/CCR3在人早孕期DSCs上的分子表达水平,并探讨其对DSCs细胞的生物学功能调节。 方法: 分离、培养并鉴定人早孕期母胎界面DSCs细胞。IHC、ELISA及FCM测定DSCs细胞分泌或表达CCL24/CCR3的水平。将DSCs与Tros细胞共培养48h,FCM检测DSCs细胞表面CCR3的分子表达水平。在体外,分别用雌二醇(E,estradiol)、孕酮(P,progesterone)和人绒毛膜促性腺素(HCG,humanchorionic gonadotropin)处理DSCs48 h,FCM检测其表面CCR3的表达情况。在体外,rhCCL24处理DSCs48h后,BrdU增殖实验检测DSCs细胞增殖,AnnexinⅤ/PI法测定DSCs细胞凋亡,并通过细胞计数判断rhCCL24对DSCs细胞数目的影响。 结果: 按已建立的蜕膜基质细胞原代培养方法,得到DSCs细胞纯度高达98%。IHC结果显示,蜕膜组织低表达或不表达CCL24,却高表达CCR3受体。ELISA检测DSCs细胞体外培养24-96 h不同时段的上清,均不能测及CCL24分子。FCM检测DSCs细胞膜上CCR3分子表达水平为(12.89±6.3)%。DSCs与Tros等比例共培养48 h后, DSCs细胞表面的CCR3表达水平明显增加,为(33.87±0.60)%。不同浓度E、P和HCG处理DSCs48 h后,DSCs细胞表面的CCR3表达水平均增加。高浓度E和P使CCR3表达增加,而HCG对CCR3表达水平的促进作用呈剂量依耐性递减。在体外,rhCCL24既促进DSCs增殖,又剂量依赖性促进其凋亡。细胞计数后发现,rhCCL24总体上促进数量增加,并以10 ng/ml效果最明显。rhCCL24对DSCs细胞的促增殖、凋亡和细胞数量增加的作用均能被CCL24中和性抗体(α-CCL24)和CCR3中和性抗体(α-CCR3)所抑制。 结论: 原代蜕膜基质细胞培养方法能得到高纯度的DSCs细胞。人早孕期母胎界面DSCs细胞不分泌趋化因子CCL24,但能表达高水平CCR3受体,提示滋养细胞来源的CCL24与DSCs细胞上CCR3结合后,可能通过旁分泌方式调解DSCs细胞功能,从而参与蜕膜化过程。Tros与DSCs共培养后,DSCs细胞膜上CCR3的表达增加,说明母胎界面Tros与DSCs直接接触状态有利于CCL24/CCR3对DSCs细胞的功能调节。体外试验中,E、P和HCG促进DSCs细胞膜表面CCR3分子表达增加,提示人早孕期高妊娠激素水平也可通过影响DSCs上CCR3的表达水平来调节DSCs的生物学功能。在体外,CCL24既促进DSCs细胞增殖,也促进其凋亡。总体上,CCL24对DSC s细胞以促进数量增加为主,从而可能促进蜕膜化过程。 第三部分 CCL24对人早孕期蜕膜γδT细胞功能调节作用 目的: 检测人早孕期蜕膜免疫细胞(DICs,decidual immunal cells)的组成及各细胞表面CCR3表达水平;测定γδT细胞上共刺激分子、增殖和凋亡相关分子的表达,并了解CCL24/CCR3对γδT细胞的功能调节作用。 方法: 原代分离、培养人早孕期母胎界面DICs细胞,FCM测定DICs中各细胞比例以及CCR3的表达水平。分离纯化γδT细胞,FCM测定其表面共刺激分子的表达水平;体外rhCCL24处理γδT细胞48 h后,FCM检测共刺激分子表达情况。FCM检测γδ T细胞增殖和凋亡分子的表达水平;体外rhCCL24处理γδT细胞48 h后,FCM检测增殖和凋亡相关分子的表达情况。 结果: DICs主要由CD3-CD56+ NK细胞组成,约占60%;CD14标记的巨噬细胞Mψ细胞和CD3+的T淋巴细胞分别占10-20%;另外,DICs中还存在少量的DC细胞。DICs中各细胞组分均表达CCR3分子,T细胞上CCR3水平最高,约为90%;γδ T细胞表面CCR3水平为(87.57±7.99)%。原代分离CD3+γδTCR+的γδT细胞纯度约为90%。测定的9种共刺激分子中,ICOS、GITR、CD40L和NKG2D表达水平较高,OX-40和PD-1中等水平表达,而CTLA-4、CD28和NKG2A表达水平较低。rhCCL24和Tros培养上清抑制γδT细胞表面ICOS、GITR和PD-1的表达水平,而Tros培养上清中加入α-CCL24或α-CCR3后,降调节作用被抑制。rhCCL24和Tros培养上清对γδT细胞表面的CD40L、NKG2D及OX-40表达的调节作用不明显。γδT细胞中等程度表达细胞增殖相关核抗原Ki67、细胞凋亡控制蛋白Bcl2和细胞凋亡膜表面分子Fas,细胞膜表面FasL表达水平低。rhCCL24或Tros培养上清处理γδT细胞48 h,均能抑制γδT细胞胞内Ki67和Bcl2表达水平,但对膜表面Fas蛋白表达的调节作用不明显。当Tros培养上清中加入α-CCL24或α-CCR3时,上清对Ki67和Bcl2表达的抑制作用部分恢复。 结论: DICs主要由NK细胞、T细胞、Mψ细胞以及少量DC细胞组成。DICs中各细胞组分均表达CCR3分子,γδ T细胞表面CCR3水平较高,提示CCL24可能调节DICs生物学功能,尤其参与对γδ T细胞功能的调节。原代细胞培养能得到较高纯度的γδ T细胞。γδ T细胞表面表达多种共刺激因子,如ICOS、GITR、CD40L、NKG2D、OX-40和PD-1。CCL24降调节GITR、ICOS和PD-1的表达;因此,CCL24可能通过抑制γδ T细胞表面共刺激因子的表达水平而调控其活化。CCL24抑制蜕膜γδ T细胞增殖,可能限制母胎局部γδT细胞数量增加,从而拮抗CCL24对外周γδT细胞的募集作用。