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背景与目的:卵巢癌（ovarian cancer）是妇科三大恶性肿瘤之一,5年生存率仅为39%。其中高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）预后最差,致死率最高[1]。临床诊断发现高级别浆液性卵巢癌症状时即为晚期并伴有腹腔扩散,主要症状包括不明的腹部不适、腹胀、食欲减退、消化不良、盆腔或下腰痛,因此常常被误诊为肠道问题,这种非特异性的临床表现也是预后较差的主要原因[2]。因此研究高级别浆液性卵巢癌早期诊断生物标志物对疾病的发展过程具有重要影响。糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰,它通过影响糖蛋白的功能、稳定性和构象而发挥特定的生物学作用。蛋白质糖基化在肿瘤发生发展过程中具有调控作用影响肿瘤的变化。甘露糖基化是蛋白质糖基化的一种,研究发现雪花莲凝集素（Galanthus nivalis lectin,GNA）所识别的糖型结构为α-1,3甘露糖基化结构[3]。α-1,3甘露糖基化由α-1,3甘露糖基转移酶（α-1,3 mannosyltransferase,ALG3）催化合成。有研究表明,ALG3在乳腺癌、肺癌等肿瘤中显示异常高表达,具有不同程度上促进肿瘤转移的作用,但ALG3在卵巢癌的发生发展中的作用及机制仍不清楚[4,5]。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（u PAR）是一种分子量为55-60KDa的细胞膜表面糖蛋白,据报道u PAR高表达在所有人类癌症中,通过纤溶酶原激活级联反应将胞外蛋白水解,可赋予恶性肿瘤细胞高度蛋白水解和迁移能力[6]。但其是否具有甘露糖基化修饰,以及在高级别浆液性卵巢癌中的作用及机制尚不清楚。本研究通过比较高级别浆液性卵巢癌和正常卵巢组织中α-1,3甘露糖基化和α-1,3甘露糖基转移酶（ALG3）的表达,分析ALG3对高级别浆液性卵巢癌转移能力的影响,探究ALG3调控靶蛋白的α-1,3甘露糖基化对卵巢癌腹膜转移作用的机制研究,并通过C57BL/6小鼠构建MOSEC（mouse ovary surface epithelial cells）腹腔转移瘤模型进一步探讨上皮性卵巢癌中ALG3对小鼠腹膜转移的影响,为临床上卵巢癌诊断和治疗提供新的分子靶点[7]。方法:1.通过Real-time PCR、Western blot、生信分析和免疫组织化学检测α-1,3甘露糖基化和α-1,3甘露糖基转移酶（ALG3）在高级别浆液性卵巢癌中与正常卵巢组织的表达情况。2.利用Western blot、Lectin blot、细胞免疫荧光方法对卵巢癌细胞（A2780）经转染敲低/过表达ALG3后,检测GNA的表达情况。3.通过Western blot检测相关增殖蛋白指标表达情况,Ed U和平板克隆形成实验在细胞功能学方面检测卵巢癌细胞的增殖能力。4.通过Western blot检测EMT相关蛋白指标表达情况,并且收集细胞上清利用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMP2/9）的活性。Transwell和黏附实验检测卵巢癌细胞转移能力的影响。5.构建u PAR-c DNA/u PAR-MUT糖基化位点突变质粒,通过Co-IP、细胞免疫荧光实验检测分别转染敲低/过表达ALG3和u PAR糖基化位点突变后后,u PAR上的α-1,3甘露糖基化的表达情况以及与u PA的结合能力。6.通过Western blot、Transwell、黏附实验进一步探讨u PAR糖基化位点突变后对卵巢癌细胞迁移侵袭与腹膜间皮细胞黏附能力的影响。7.此外,构建C57BL/6小鼠MOSEC模型,检测敲低ALG3和凝集素GNA封闭后对小鼠卵巢癌腹膜转移能力的影响。结果:1.Real-time PCR、Western blot、生信分析和免疫组织化学结果显示,与正常卵巢组织相比,α-1,3甘露糖基化和α-1,3甘露糖基转移酶（ALG3）在高级别浆液性卵巢癌中高表达。选取GEPIA数据库显示在卵巢癌患者中ALG3高表达,通过Kaplan Meier分析表明,患者高表达ALG3的生存期（OS）最短。2.Western blot、Lectin blot、细胞免疫荧光结果显示敲低/过表达ALG3后可以抑制或促进A2780卵巢癌细胞α-1,3甘露糖基化的表达。3.Western blot、Ed U、平板克隆形成实验结果表明敲低/过表达ALG3均可抑制或促进卵巢癌细胞的增殖能力。4.Western blot、Transwell和黏附实验结果显示敲低/过表达ALG3可以抑制或促进卵巢癌细胞的迁移侵袭以及与腹膜间皮细胞的黏附能力。明胶酶谱实验显示细胞培养液中MMP2、MMP9的表达。结果表明,敲低/过表达ALG3后,活化型MMP2及MMP9的表达降低或增高。5.Co-IP和细胞免疫荧光实验结果显示敲低/过表达ALG3后可以降低或增高u PAR上α-1,3甘露糖基化的修饰以及与u PA的结合能力。与过表达组相比较,u PAR糖基化位点突变后可抑制u PAR上α-1,3甘露糖基化的表达以及与u PA的结合能力。6.Western blot、Transwell、黏附实验结果显示:与过表达组相比较,u PAR糖基化位点突变后抑制卵巢癌的EMT、迁移侵袭以及与腹膜间皮细胞黏附能力。7.MOSEC模型中发现敲低ALG3和凝集素GNA封闭组均有效抑制了小鼠体内卵巢癌腹膜转移能力。结论:1.α-1,3甘露糖基化和α-1,3甘露糖基转移酶（ALG3）在高级别浆液性卵巢癌中表达水平升高。2.敲低ALG3抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移侵袭以及与腹膜间皮细胞黏附的能力。ALG3调控u PAR分子上α-1,3甘露糖基化以及与u PA的结合能力同时促进卵巢癌细胞的腹膜转移。3.敲低ALG3和凝集素GNA封闭均可有效抑制在MOSEC模型中卵巢癌的腹膜转移和恶性腹水的生成。