背景:甲硫氨酸亚砜还原酶A(Methionine sulfoxide reductase A,MsrA)是广泛分布在动植物细胞内的氧化还原调节蛋白,在有氧环境下参与细胞防御和抗衰老过程,是细胞内重要的抗氧化酶。它参与众多的疾病与病理过程,近年来发现心肌缺血再灌注,阿兹海默病,白内障,帕金森病等疾病的病理过程同MsrA密切相关,且涉及的作用底物众多。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是炎症介导并伴随氧化应激的慢性心血管疾病,它所引起的一系列心血管疾病是目前世界致死致残率最高的一类疾病。许多黄酮类物质对心血管疾病,阿兹海默病,白内障,帕金森病等有良好的治疗效果,已知的原花青素(Procyanidins,PC)、槲皮素(Quercetin)、甘草酸(Glycyrrhizin)、异甘草素(Isoquiritigenin)等是广泛存在于植物中的生物类黄酮化合物。现代药理学研究表明,这类物质有广泛的抗炎抗氧化药物活性,具有抑制肿瘤,改善微循环,防治心血管系统疾病,保护脑和神经,皮肤保健等多种功能。分子生物学的许多研究表明,黄酮类化合物发挥功能的目标靶分子为蛋白质,发挥活性的实质是药物与靶向分子之间的相互作用力,而其活性的高低则取决于它们与靶向分子间的作用方式和亲和力的大小。本课题拟探究四种黄酮类药物是与MsrA的相互作用。方法:将含有重组表达载体BL21-pET28a/hMsrA大肠杆菌培养并异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后,利用 Ni-NTA 亲和层析的方法获得有活性高纯度的hMsrA蛋白。10%的SDS-PAGE胶电泳鉴定hMsrA的蛋白纯度。利用荧光光谱滴定法和BIAcoreT200分子互相作用系统检测并分析四种黄酮类小分子原花青素、槲皮素、甘草酸、异甘草素与MsrA之间的相互作用。二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)氧化法检测黄酮类小分子物质对MsrA活性的影响。结果:(1)经SDS-PAGE胶电泳和蛋白酶活性的检测显示,Ni-NTA亲和层析法可获得高纯度高活性的hMsrA蛋白。(2)A):荧光光谱滴定实验结果显示:在280nm的激发波长条件下,随着黄酮类小分子物质浓度的不断增加,引起MsrA的内源荧光发生淬灭,表明这些药物小分子可与MsrA发生相互作用。但异甘草素与其他三类小分子间存在差异性,随着异甘草素浓度的不断增加,MsrA的荧光波峰位置发生了蓝移,表明MsrA蛋白的芳香族氨基酸残基微环境的极性发生了改变。B):随着温度(291K、298K、303K、310K)的不断增加,四个黄酮类小分子物质对MsrA作用的淬灭常数KQ不断减小,表明这四个黄酮类小分子物质与MsrA相互作用的淬灭过程以静态淬灭为主。C):在不同温度下绘制黄酮类小分子物质与MsrA的Lg[(F0-F)/F]∽Lg[Q]的双对数图,根据截距和斜率求得相应的Kb和n。结果显示,MsrA与这四类小分子物质相互作用的结合位点n都接近于1。原花青素,槲皮素,甘草酸,异甘草素与MsrA的结合常数Kb的值在104数量级以上,表明这几种黄酮类物质可以与MsrA之间有较弱强度的结合力。D):热力学分析发现,这四类物质与MsrA的自由能变△G0<0,表明这四类小分子物质与MsrA的结合是一个放热过程,且是一个自发过程。异甘草素,甘草酸,原花青素与MsrA相互作用的作用力主要为疏水作用力,槲皮素与MsrA相互作用的作用力主要为氢键和范德华力。(3)BIAcore T200分子相互作用系统分析了四个黄酮类小分子与甲硫氨酸亚砜还原酶A的动力学,亲和力参数,MsrA与这四类黄酮类物质有较弱强度的相互作用(4)四种黄酮类小分子与甲硫氨酸亚砜还原酶A相互作用后,改变了甲硫氨酸亚砜还原酶A的活性,MsrA的活性均有不同程度的降低。结论:具有抗炎抗氧化的这一类生物黄酮类化合物可以与甲硫氨酸亚砜还原酶A发生相互作用,在适当浓度的黄酮类物质条件下,黄酮类物质改变了甲硫氨酸亚砜还原酶A的活性,可能影响了其在生物体类发挥的功能。我们的研究为探究甲硫氨酸亚砜还原酶A的生物活性功能提供了更好的生物化学研究方向。