不同培养条件对鸭疫里氏杆菌外膜蛋白表达的影响及外膜蛋白A基因片段克隆与表达

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鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染是养鸭业重要疾病。现发现有21个血清型,各血清型之间的保护力很弱。国内外虽然已经有较多的研究,但对毒力因子,及保护性抗原的研究还未充分展开。 外膜(Outer membrane)是革兰氏阴性菌细胞壁中的特有结构,位于外膜上的蛋白总称为外膜蛋白(Outer membrane proteins,Omps)。某些外膜蛋白与细菌的毒力及免疫原性有关。 用加入金属离子螯合剂EDTA的TSB(胰酪胨大豆肉汤)培养基,培养鸭疫里氏杆菌RA1型,将未加入EDTA的TSB培养的RA1型菌作对照。比较后发现,加入EDTA组的Omp的SDS-PAGE图谱发生改变,从34kD-100kD增加了多条蛋白条带,特别是39 kD,60kD和110kD蛋白浓度较大。用鸭康复血清作为一抗,自制酶标兔抗鸭为二抗作Western-blot,与对照组相比,实验组增加了39kD条带。实验证明,加入金属离子螯合剂EDTA对外膜蛋白的表达和免疫原性均有影响。 用生物信息学软件DNAStar分析RA ATCC11845株和CVL 110/89株OmpA基因序列,推测其中一段序列为RA各血清型共有的保守序列。用Primer Premier 5.0自行设计一对引物。参考菌株和分离株均扩增出特异性的498片段,经EcoR Ⅰ酶切及测序鉴定,各株均为RA,重复试验证明该方法可以特异快速地鉴定RA。 利用上述分析所得的RA各血清型共有的保守序列,用Primer Premier 5.0自行设计一对含双酶切位点的引物。以该菌RA2型参考株DNA为模板。501bp的PCR产物按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET-32a(+)中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,表达分子量约为27KD的融合蛋白。免疫转印显示,表达的蛋白可被RA1型和RA2型全菌鸭血清识别,这可证明OMPA有位于菌体表达的结构,并能与不同血清型的RA结合。
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