食管癌是一种较为常见的恶性肿瘤之一,居世界癌症死亡的第六位。其发病率受地区的影响较大,尤其在河南省林州市的发病率高达100/10万以上。食管癌的发生与某些地区人民的生活习惯、自然环境等因素密切相关,但其确切的病因至今未明了。目前食管癌的治疗还主要局限在手术治疗、放射治疗、药物治疗和免疫治疗等方法,但这些方法均不能达到令人满意的效果,而肿瘤的浸润、转移在肿瘤的发生、发展中起着十分重要的作用。siRNA在肿瘤领域中的应用是一个新兴发展的产业,由于其高效、低毒及快捷等特点而受到医学界同行的广泛关注,因此寻找食管癌新的分子治疗靶点近年来愈来愈受到广泛关注。paxillin是近年来发现的一种重要的细胞黏附因子,是致瘤性酪氨酸激酶的一种底物,可以调节细胞的移动和播散等功能,从而提高肿瘤细胞转移和侵袭的能力。多项研究表明paxillin有参与动态调节黏着斑、调节细胞的移动和播散等功能。而肿瘤的浸润和转移与细胞的黏附力、移动力的改变直接相关,提示paxillin在肿瘤细胞的浸润和转移中起着十分重要的作用。整合素介导的信号转导过程中的关键信号分子FAK在肿瘤侵袭转移中起到非常重要的作用。研究发现FAK在细胞粘附、运动及信号转导中起重要作用,而且还调节着多细胞生物的分裂、尘长、发育和凋亡等生物学行为。目前已发现FAK在人类许多不同类型的肿瘤中呈过度表达,而在良性肿瘤或正常组织中无显著增高。FAK在肿瘤向恶性侵袭表型演进过程中起重要作用,其与肿瘤侵袭的高度相关性已在一些研究中得已证实。paxillin和FAK均是与细胞粘附相关的蛋白,是整合素介导的信号调控途径中的两个关键性的信号分子。近来研究表明,paxillin和FAK在细胞迁移、细胞增殖和生存中起着十分重要的作用。目前,paxillin和FAK蛋白作为整合素介导的信号转导途径中的两个关键性的信号分子,在食管鳞癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、喉鳞状细胞癌、肺癌等不同的肿瘤组织中的作用均有不同程度的报道,然而,paxiltin和FAK的联合检测在食管鳞癌EC9706细胞中的作用以及利用siRNA技术抑制paxillin基因的表达引起的食管鳞癌细胞相应的生物学行为的变化也未见报道。因此,本研究利用paxillin siRNA转染食管鳞癌EC9706细胞,通过免疫细胞化学、半定量RT-PCR及Western blotting方法研究paxillin基因表达的下调对食管鳞癌EC9706细胞中FAK和MMP-2的表达的影响,初步阐明三者相互调控之间的关系,进一步通过Boyden chamber研究其对细胞迁移能力的影响。该研究旨在通过研究食管鳞癌浸润转移调控途径,进一步利用现代分子生物学技术阻断信号途径中的关键调控基因,为食管鳞癌的转移机制提供新的理论依据和实验基础。方法1.paxillin siRNA转染食管鳞癌EC9706细胞将paxillin siRNA利用脂质体2000转染食管鳞癌EC9706细胞,于48h后收集细胞,用于下面的免疫细胞化学、半定量RT-PCR、Western blotting以及细胞侵袭实验。2.免疫细胞化学分析paxillin和FAK蛋白的表达将上述收集好的细胞,分别爬片,然后利用免疫细胞化学法检测paxillin和FAK蛋白的表达。3.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表达根据操作说明用Trizol试剂提取总RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis试剂盒合成cDNA第一链。利用合成的特异性PCR引物进行扩增,利用β-actin作为内参。扩增结束进行电泳检测,并利用Gene Tools进行基因相对表达分析。4.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的表达将上述收集的细胞在裂解缓冲液中进行裂解。然后将收集的总蛋白于10%SDS-PAGE电泳,通过电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含5%脱脂奶粉的PBS-T于室温封闭2小时,然后分别加一抗(paxillin,FAK,MMP-2及β-actin)于含1%脱脂奶粉的PBS-T进行稀释,接着加兔抗连接辣根过氧化物酶的二抗,最后用Gene Tools进行蛋白相对表达量分析。5.Boyden chamber分析转染前后细胞迁移能力的变化将各组细胞接种于上层,Boyden chamber实验计算各组穿膜的细胞数,然后比较转染paxillin siRNA后EC9706细胞迁移能力的变化。6.统计学处理免疫细胞化学采用χ~2检验;RT-PCR和Western blotting结果均采用GeneTools软件进行灰度值分析,上述试验均分别重复三次。统计学处理均采用SPSS13.0统计软件,统计学数据用均数±标准差((?)±s)表示,行单因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05具显著性。结果1.免疫细胞化学检测paxillin和FAK蛋白的表达免疫细胞化学结果显示,三组细胞中转染paxillin siRNA组中paxillin和FAK蛋白表达阳性细胞数最低(P＜0.05),而未处理组和转染siRNA对照组中其表达阳性细胞数较高,但两者之间统计学上无差异(P＞0.05)。2.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表达转染paxillin siRNA后,与对照组及转染空载体对照组相比,转染paxillinsiRNA组中的paxillin mRNA的表达量明显下调。此外,FAK及MMP-2 mRNA相对含量也显著下调。3.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的表达转染paxillin siRNA后,与对照组及转染空载体对照组相比,转染paxillinsiRNA组中的paxillin蛋白的表达量明显下调。此外,FAK及MMP-2蛋白相对含量也显著下调。4.Boyden chamber分析转染前后细胞迁移能力的变化结果表明,与未处理组及转染siRNA对照组相比,转染paxillin siRNA组穿膜的细胞数明显下降(P＜0.05),但未处理组及转染siRNA对照组相比,在统计学上无差异(P＞0.05)。结论1.paxillin siRNA转染后,食管鳞癌EC9706细胞中paxillin、FAK及MMP-2的mRNA及蛋白的表达均明显下调。2.paxillin蛋白表达的下调能引起FAK及MMP-2 mRNA和蛋白表达的下降。3.paxillin表达的下调能降低食管鳞癌EC9706细胞的侵袭能力,可能是通过FAK和MMP-2表达下调介导的。