副溶血性弧菌是引起食物中毒的一种重要的致病菌,也是目前沿海地区首要的食源性致病菌,广泛存在于鱼、虾、蟹、贝等海产品中,因此高效快速的检测副溶血性弧菌对食品安全、疾病监测等领域具有非常重要的意义。为了更简单、快速的检测副溶血性弧菌,本文研究了三种等温核酸扩增反应。首先,研究了一种基于切刻内切酶和DNA聚合酶的等温链置换指数扩增反应,但实验结果表明切刻内切酶的存在容易导致非特异性扩增。因此,为了避免切刻内切酶造成的非特异性扩增,本论文又选取了不含切刻内切酶仅含一种DNA聚合酶的等温核酸扩增反应——环介导等温扩增反应对副溶血性弧菌进行检测,检测结果表明该反应对检测副溶血性弧菌具有良好的特异性和抗干扰能力,检测限低至10 aM。本论文在利用环介导等温扩增反应检测副溶血性弧菌过程中发现甜菜碱的存在不仅无法促进反应的进行,反而会降低反应效率,而甜菜碱在环介导等温扩增反应发明时就存在于反应体系中,且目前已广泛应用于等温核酸扩增反应,是常用核酸反应添加剂。对此,本论文对甜菜碱降低等温核酸扩增反应机理进行了更深入地研究,结果表明甜菜碱阻碍了互补单链DNA的有效碰撞结合,减小了结合速率常数K1,从而降低了反应效率,其中0.8 M甜菜碱约使环介导等温扩增反应速率降至1%。本文已经证明,在等温核酸扩增反应中,甜菜碱作为一种常用添加剂,可以减小反应效率,且阐明了甜菜碱影响的机理。因此,甜菜碱可以从等温核酸扩增反应中剔除出来,从而简化反应体系,降低实验成本,提高反应效率,缩短反应时间。这一发现将大大加快等温核酸扩增法的发展,更适宜于在POCT等领域的应用。此外,本文又利用实验室建立的一种仅需DNA聚合酶的新型等温核酸扩增反应——变性泡介导的链交换扩增反应对副溶血性弧菌进行了检测。实验结果表明,变性泡介导的链交换扩增反应对副溶血性弧菌的检测限可达到10 pM,且特异性高、抗干扰能力强。由于甜菜碱能够降低结合速率常数K1,阻碍互补单链间的杂交,因此本文推测增加解离速率常数K2的物质能够促进双链的解离,从而促进相关反应的进行。因此,本文又进行了常用添加剂对链交换反应影响的实验。实验结果表明普鲁兰多糖、甜菜碱、二硫苏糖醇、海藻糖对链交换反应几乎没有促进效果;十六烷基三甲基溴化铵、二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000对链交换反应有促进作用,其中20%甲酰胺、30%聚乙二醇200、40%二甲基亚砜对链交换反应促进效果最佳。经实验验证聚乙二醇200能够解旋双链DNA,增大DNA双链解离速率常数K2,促进DNA自组装反应效率,对核酸反应如DNA折叠等的发展具有重要意义。