论文部分内容阅读
七次跨膜的蛋白分子是一个膜表面分子超家族，包括100多个家族成员。它们主要作为一些小分子物质如肽类，激素，细胞因子和多种离子的受体，主要功能是介导细胞外信号传递和调节细胞的生物学功能。如G蛋白偶联受体通过G蛋白介导产生胞内信使（cAMP，cGMP，DG，IP3）将胞外信号传递到胞内，从而引起生物学效应；内质网上也存在着一些跨膜蛋白，其中一些与蛋白质的合成及运输有关，一些与物质代谢有关，如葡萄糖-6-磷酸酶。跨膜蛋白介导的信号传递往往具有重要的生物学意义，例如Wnts与属于卷曲蛋白家族的七次跨膜蛋白受体结合后，激活胞质dishevelled蛋白发挥其生物学功能激活特定基因转录，在胚胎发育过程中起着非常重要的作用。 本研究工作，利用本室构建的核定位信号筛选系统从小鼠胚胎cDNA文库中克隆到一个新的全长cDNA片段，分析表明在其1802bp 育回军区大学刃士学位论文 的序列中含有一个长1293hp的开放阅读框，编码431个氨基酸。用 BLAST软件在GenBank中没有发现与之同源的核昔酸序列，但在人类 基因组（GenBank登录号为AL139392）包含这段序列，位于6号染色 体pll二21．1。计算机软件分析表明，其编码的蛋白具有多次跨膜样结 构域。我们 将其命名为 EMT－l DdoPlasmic retlculm－locallied Multi《pan Transmembrane proteinq)登录到 GenB咖 登录号为 AF4 90。 通过No，them杂交和MTE膜杂交分析了EMT－l在不同组织中的 表达情况，结果显示EMT－l在人和小鼠的多种组织。肿瘤细胞以及不 同发育时期的小鼠胚胎组织中均有表达，且这种表达随着胚胎发育有升 高的趋势。这种广泛表达的特点提示EMT．l可能具有重要的生物学功 gg。 蛋白质分子的功能与其细胞内定位有密切的关系，因此我们对 EMT．1进行了初步的细胞内定位分析。多种计算机软件分析表明EMT－l 是一个具有多次跨膜结构域的蛋白分子，并且具有内质网定位信号。我 们用绿色荧光蛋白融合于EMT－l全长及其不同截断形式的梭基和氨基 端，瞬时转染COS－7细胞，通过荧光显微镜观察，发现EMT－l编码的 蛋白呈现内质网定位的特点。 为了进一步证实EMT－l 在细胞内的定位及组织分布，拟制备抗 EMT－l抗体，进行免疫组化验证。为此将EMT－l氨基末端基因克隆入 融合表达载体PRSETB中，转化大肠杆菌BL－21，经IPTG诱导，表达HIS6－ EMT－l融合蛋白，表达产物分子量约为24Ku。并用Western七h的方法 检测了表达产物。为制备抗EMT．l抗体奠定了基础。