论文部分内容阅读
生物细胞内存在复杂且精密的信号网络用来调控自身的各种生理生化过程,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和酸碱度(pH)作为信号转导网络中重要的组成部分,参与调控细胞的生长。细胞内的ROS与细胞的极性生长、分化、胁迫应答等过程密切相关;同样的,细胞内pH也可以维持蛋白质的结构和功能,调控代谢反应,pH的动态变化参与调控细胞的分裂和衰老等过程。因此,ROS和pH状态在细胞内受到严密调控,环境信号刺激和细胞的生长状态均能使得胞内ROS和pH发生改变,而实时的监测活细胞体内的ROS和pH变化对揭示细胞信号转导过程有重要意义。本研究利用植物光受体蛋白光、氧与电压感受(Light,Oxygen,Voltage-sensing,LOV)结构域,与红色荧光蛋白mKATE的突变体mBeRFP融合,构建了可在植物体中应用的双功能荧光探针。LOV的突变体LOV2具有很好的氧化还原敏感性,mBeRFP对氧化还原剂不敏感,而对pH非常敏感。利用LOV2与mBeRFP的融合蛋白,可以实现同时检测细胞内的氧化还原电势(Eh)和pH水平,研究者将这种融合探针命名为pHaROS2。在植物原生质体表达pHaROS2探针并在细胞内对pHaROS2进行Eh和pH标定,实现了 pHaROS2探针对细胞内Eh和pH的实时监测。利用激光共聚焦显微镜对pHaROS2转基因拟南芥植株的气孔保卫细胞和根毛细胞进行荧光观察,检测pHaROS2在植物体内的成像效果。之后,我们利用pHaROS2探针观察拟南芥根毛在各种不同胁迫处理下Eh和pH的变化,和根毛生长发育过程中氧化还原状态和pH的变化。同时对pHaROS2探针进行改进,通过与细胞内清除过氧化氢(H2O2)的APX1融合构建H2O2特异性探针,在酵母中验证发现改造后的探针具有H2O2特异性。本研究证明了改造的pHaROS2探针具有良好的荧光属性,可以应用于拟南芥、酵母等检测细胞内的Eh和pH的水平。该探针还可用于拟南芥的氧化还原或pH突变体植株中的Eh和pH的定量检测,为研究提供重要检测工具。此外,pHaROS2具有较高的可塑性,可以和其他转录因子或基因搭配,构建成具有更多功能的荧光探针,为细胞成像研究者提供一大助力。