家鸡神经激肽B基因的克隆鉴定、启动子分析、组织表达图谱及功能探究

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NKB隶属于速激肽家族,在脊椎动物中高度保守,可参与众多生理功能,如调节焦虑、平滑肌收缩、松弛血管等作用。近年来,因其对生殖系统具有重要调控作用而引发人们的关注。目前,在鸟类中缺乏相关研究,家鸡是鸟类模式动物,亦是重要的经济动物。因此,本研究以家鸡为模型,克隆了家鸡cTAC3 cDNA全长、并对其启动子、组织分布和功能进行了探究。结果表明:(1)利用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次克隆了家鸡TAC3 cDNA序列全长并明确了其基因结构。cTAC3由5个外显子构成,cDNA全长787 bp,可编码含132Aa的前体蛋白,水解生成的成熟肽(10 Aa)在脊椎动物中高度保守。(2)cTAC3启动子区位于-1523/+85 bp区域,含有GATA1、CREB、E2、SP1、GC box、TATA box,其中核心启动子位于-37/+85 bp。(3)qPCR结果表明cTAC3、cTACR3 mRNA具有广泛的组织分布,在下丘脑中表达量较高。在家鸡发育过程中,下丘脑和垂体中cTAC3 mRNA表达水平呈上升趋势,cTACR3 mRNA在下丘脑发育过程表达量不断增加,而垂体中的表达量降低,提示cTAC3/cTACR3在家鸡体内发挥潜在的生殖调控作用。(4)利用pGL3-CRE-luciferase和pGL4-SRE-luciferase报告系统,明确了cNKB可高效激活cTACR3,介导胞内cAMP/PKA和MAPK/PKC信号通路。并且cTACR3第235位氨基酸残基对其与cNKB的作用效应具有重要作用。(5)体内试验结果表明,cNKB促进家鸡下丘脑GnRH-Ⅰ的表达,刺激垂体LH和FSH的合成。利用家鸡垂体细胞培养体系,证实了cNKB可直接作用于垂体,影响cFSHβ和cLHβmRNA的表达,并具有性别差异,对雌性表现为促进作用而对雄性抑制。本研究首次克隆了家鸡TAC3 cDNA全长,并系统的探究了其在家鸡中的作用及作用机理。研究结果不仅明确了cNKB对家鸡生殖调控功能,同时,也为揭示其在脊椎动物中保守功能提供线索。
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