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不可控出血是造成战伤死亡、意外死亡和外科手术死亡的重要原因,理想的止血材料对减少出血致死十分重要。自组装多肽RADA-16(RADARADARADARADA)是化学合成的一种小肽。1%的RADA-16溶液(w/v)接触出血创面后,迅速自组装成网状纳米纤维屏障,可在15s内终止成年仓鼠脑、脊髓、股动脉、肝等部位的创伤出血。已被美国麻省理工学院下属公司开发为止血产品。由于来源依赖合成,纯化困难,价格昂贵,目前仅用于脑外科手术,应用范围和受惠人群极大受限。解决该问题的关键在于降低RADA-16的生产成本。基因工程菌发酵是目前低成本获取药用蛋白的首选方法。但是,RADA-16相对而言分子量偏低,稳定性太差而难以获得理想的表达水平。因此提高RADA-16在宿主细胞中的稳定性是实现基因工程法生产RADA-16的关键,而将RADA-16与其他蛋白融合表达有利于提高其表达产物稳定性。类弹性蛋白是基于天然牛弹性蛋白序列中高频出现的短小重复序列VPGXG(X是Pro以外的任何一种氨基酸),利用过基因重组技术得到的一种多肽,具有天然弹性蛋白的部分活性,已被应用于细胞培养、组织修复、药物缓释和标签纯化蛋白。本研究拟利用基因工程技术将课题组已经克隆化的不同长度的类人弹性蛋白编码基因与RADA-16编码基因连接重组,构建类人弹性蛋白(hELPs)融合RADA-16原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,筛选出能够高效、稳定过表达的融合蛋白hELPs-RADA-16的工程化大肠杆菌菌株并对其止血性能进行分析。研究获得以下结果(1)成功构建了三种原核表达载体pET28a(+)-h ELP36-RADA-16、pET28a(+)-h ELP60-RADA-16、pET28a(+)-h ELP96-RADA-16;(2)将上述三种质粒成功导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并实现过表达,表达产物分别称为h ELP36R、h ELP60R、h ELP96R,灰度扫描分析、SDS-PAGE检测结果显示h ELP36R、h ELP60R、h ELP96R的表达量分别为16.35%,17.80%,21.57%且以可溶形式在BL21(DE3)表达和积累,Western-Blot分析结果显示过表达的蛋白为目的蛋白;(3)利用二轮相变可逆循环纯化3种融合蛋白,得到的h ELP36R、h ELP60R、h ELP96R蛋白纯度分别为:58.84%,73.73%,79.2%。镍填料进一步纯化发现h ELP36R在200mol/m L咪唑洗脱缓冲液时纯度较高94.72%,h ELP60R在300mol/m L咪唑洗脱缓冲液时纯度较高96.91%,发现h ELP96R在300mol/m L咪唑洗脱缓冲液时纯度较高96.37%但镍填料纯化对提高h ELP60R、h ELP96R纯度作用不大;(4)无菌蛋白包被96孔板进行细胞增殖和细胞迁移实验,实验结果显示三种融合蛋白在培养早期能够促进细胞增殖,但是培养72h后,与胶原蛋白和RADA-16阳性对照组相比,各处理组之间细胞的增殖能力没有显著性差异,培养24h时具有显著性细胞迁移能力(P<0.001),但是在培养36h,48h时没有表现出显著性差异;(5)以h ELP36R、h ELP60R、h ELP96R冻干蛋白膜片进行小鼠肝脏止血实验,阳性对照为吸附有浓度为1%的RADA-16纱布,鼠尾胶原蛋白,阴性对照不做任何处理。与阴性对照组相比,三种融合蛋白均有止血能力(P<0.001),h ELP36R的平均止血时间为27.21±1.84s,h ELP60R的平均止血时间为18.65±1.97s,h ELP36R和h ELP60R的止血时间均大于阳性对照组RADA纱布(14.44±1.33s)和胶原蛋白(21.23±1.84s)组,h ELP96R的止血时间(15.86±1.21s)介于胶原蛋白和RADA纱布之间。