研究背景:肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）是一组不同原因导致的以肺血管阻力增加以及肺血管重塑为特征的“类似癌症”的症候群,如不及时治疗,临床预后很差。肺高压原因复杂且不十分明确,可能与先天畸形、基因易感性、缺氧以及代谢异常等多种因素相关。PAH的发病机制复杂。肺小血管收缩、血栓形成和肺血管重塑共同参与了PAH的发病机制。肺动脉的血管收缩是PAH发病机制中的一个重要因素。血管收缩主要由血管活性因子失衡引起。血管的正常收缩由前列环素、内皮素-1和一氧化氮三条通路维持[1],而在PAH中这三条通路失衡。微血栓的形成在PAH的进展中起着重要的控制作用。肺血管重塑是PAH发病机制中的关键因素。肺血管重塑过程包含了细胞过度增殖、代谢改变、克隆扩增、以及抵抗程序性死亡。目前PAH的治疗主要抑制血管收缩,对改善肺血管重建的作用有限。药物治疗主要包括钙通道受体阻滞剂、内皮素类的受体拮抗剂、前列腺素类似物和前列环素的受体激动剂、可溶性鸟苷酸环化酶激动剂和磷酸二酯酶-5抑制剂等。多数患者临床预后大为改观,但仍有部分患者对多种药物治疗效果欠佳。尚没有针对性的治疗方法解决肺血管重建,因此关注肺小动脉重塑过程中潜在的分子机制,可能为PAH的治疗带来开创性进展。随着微阵列和下一代测序技术的不断发展,多种非蛋白编码核糖核酸（Ribonucleic acid,RNA）在疾病中的众多功能备受关注。其中微小核糖核酸（microRNA,miRNA）、长非编码 RNA 和环状核糖核酸（circular RNAs,circRNAs）成为血管功能的新调节剂,特别是在高血压和PAH中发挥重要作用。CircRNAs是一种新型的由套索驱动的或内含子配对驱动的RNA分子。由于circRNAs缺乏末端5’端帽和3’多聚腺苷酸化尾,因此circRNAs非常稳定,不易被核糖核酸酶R（Ribonuclease,RNase R）和其他核酸外切酶分解[2-4]。大量广泛而丰富的circRNAs被发现[5-8]。CircRNAs的多种生物学功能及特性也被人们逐渐认识。CircRNAs参与了血管功能障碍、血管的发育、血管生长和重塑等多个过程。CircRNAs失调通过多种机制参与血管重建,如表型转换、增殖、迁移。提示circRNAs可能通过调节血管重塑参与了PAH的发生和进展。CircRNAs作为非编码RNA的新成员,可能作为PAH诊断和治疗的新靶点。本研究以肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）为研究对象,模拟PAH的细胞模型。根据RNA测序结果分析出差异表达的circRNAs、mRNAs。发现缺氧 PASMCs 中mmucirc0001907 表达明显上调,其亲本基因为谷氨酸代谢型受体1（Glutamate receptor metabotropic1,Grm1）为调控肺动脉平滑肌细胞功能的潜在分子。选择circRNA-Grm1（mmucirc0001907）为代表研究circRNAs在缺氧性PASMCs增殖、迁移中的作用,并初步探讨其与RNA结合蛋白Fus结合靶向调控Grm1的分子机制,为缺氧性PAH的治疗提供新的分子靶点。第一部分:缺氧肺动脉平滑肌细胞中差异表达的circRNAs的筛选与功能验证研究目的构建缺氧PASMCs模型,高通量测序筛选差异表达的circRNAs,选取目标circRNA。探讨circRNA在缺氧PASMCs增殖和迁移中的作用。研究方法1.原代PASMCs培养及细胞鉴定。2.将PASMCs置于缺氧培养箱（3%O2）,建立缺氧PASMCs模型。提取总RNA,高通量测序检测常氧和缺氧培养的circRNAs,筛选出表达明显差异的circRNAs。3.将circ-Grm1特异性siRNA转染入PASMCs敲降circ-Grm1表达,探讨circ-Grm1对PASMCs增殖、迁移的影响。3.1实时荧光定量PCR验证siRNAs转染效率。3.2 CCK-8、EDU实验检测circ-Grm1对PASMCs增殖的影响。3.3划痕实验、Transwell实验检测circ-Grm1对PASMCs迁移的影响。3.4流式细胞检测circ-Grm1对PASMCs细胞周期的影响。3.5蛋白印迹（Western Blot,WB）检测circ-Grm1对基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase,MMP）2,MMP9,细胞周期蛋白 A（cyclin A）,增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）,Ki67 蛋白,细胞周期蛋白依赖激酶 1（Cyclin dependent kinase1,CDK-1）表达的影响。研究结果1.免疫荧光实验证实培养细胞为平滑肌细胞,培养细胞α-SMA表达率高于97%,说明培养的原代PASMCs纯度高。2.高通量测序发现以正常培养的PASMCs为对照,缺氧PASMCs中筛选出13个表达上调,9个表达下调的circRNAs,做出差异表达基因聚类热图,从中挑选出 mmucirc0001907（circ-Grm1）作为目标 circRNA。3.Circ-Grm1对PASMCs增殖、迁移的影响。3.1 实时荧光定量 PCR 反应（Quantitative Real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR）证明转染si-circ-Grm1后,circ-Grm1的相对表达较缺氧对照组（si-NC）明显下降（**P＜0.01）,提示转染有效。3.2CCK-8、EdU 显示与对照组（Normoxia）相比,缺氧组（si-NC,si-circ-1,si-circ-2）细胞增殖明显增强（**P＜0.01）;与si-NC组相比,敲降circ-Grm1后细胞增殖明显减弱（**P＜0.01）。3.3细胞划痕、Transwell实验显示与Normoxia组相比,缺氧组（si-NC,si-circ-1,si-circ-2）细胞迁移能力明显增强（**P＜0.01）;与si-NC组相比,敲降circ-Grm1后细胞迁移能力明显下降（**P＜0.01）。3.4流式细胞术证实与Normoxia组相比,缺氧组（si-NC,si-circ-1,si-circ-2）细胞周期进程加速,细胞增殖明显增强（**P＜0.05）。与si-NC组相比,敲降circ-Grm1后细胞周期进程阻滞,细胞增殖被抑制（**P＜0.05）。3.5 WB 显示与常氧组相比,缺氧组（si-NC,si-circ-1,si-circ-2）细胞 cyclin A、PCNA、CDK-1、Ki67、MMP2、MMP9 表达均显著增加（**P＜0.01）;与si-NC 组相比,敲降 circ-Grm1 后 PASMCs 中 cyclin A、PCNA、CDK-1、Ki67、MMP2、MMP9表达均显著下降（**P＜0.01）。第二部分:Circ-Grm1调控缺氧肺动脉平滑肌细胞功能的机制研究研究目的预测并验证circ-Grm1的RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）,研究circ-Grm1与RBP结合对靶基因Grm1稳定性和表达的影响,探讨circ-Grm1调控缺氧PASMCs功能的分子机制。研究方法1.高通量测序检测缺氧组和常氧组PASMCs中差异表达的mRNAs。2.预测并证实circ-Grm1的RBP。2.1 通过 starbase 网站预测 circ-Grm1 的 RBP,通过网站 RNA-Protein Interaction Prediction（RPISeq）预测 circ-Grm1 与 RBP 之间的结合丰度。2.2通过核糖核酸免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验和下拉实验（pull down）验证 circ-Grm1 和 Fus 的结合。3.Circ-Grm1与Fus结合对Grm1 mRNA稳定性和表达的影响。3.1放线菌素D检测circ-Grm1与Fus结合对Grm1 mRNA稳定性的影响。3.1.1通过转染小干扰RNA敲降Fus、以及circ-Grm1的表达。QRT-PCR验证siRNAs转染效率。3.1.2放线菌素D实验检测circ-Grm1与Fus结合对Grm1 mRNA稳定性的影响。分别在不同时间点,检测不同组细胞Grm1的表达水平,并绘制Grm1的降解曲线。3.2 WB检测circ-Grm1与Fus结合对Grm1 mRNA表达的影响。WB检测不同处理组细胞Grm1的表达。4.Grm1在circ-Grm1对PASMCs增殖、迁移的调节中的作用。4.1通过质粒转染过表达Grm1、circ-Grm1,qRT-PCR验证质粒转染的效率。4.2 WB检测过表达circ-Grm、Grm1对Grm1表达的影响。4.3分别通过CCK-8实验、EdU实验、WB实验、Transwell实验、划痕实验检测Grm1对circ-Grm1在缺氧PASMCs增殖、迁移中作用的影响。5.分析并验证circ-Grm1调控Grm1表达的相关信号通路。5.1 KEGG富集性分析探讨相关信号通路。5.2 WB检测信号通路相关的蛋白。研究结果1.高通量测序结果发现与常氧组相比,缺氧组中1644个mRNAs表达上调,2098个mRNAs表达下调。通过circBase检索到circ-Grm1的靶基因为Grm1。同时芯片结果分析在差异表达的目的基因中检测到Grm1表达下调,与网站预测结果一致,确定Grm1为circ-Grm1的靶基因。2.预测并证实circ-Grm1的RBP为Fus。2.1 通过 starbase 网站预测 circ-Grm1 的 RBP 为 Fus,RPISeq 预测 circ-Grm1与Fus的随机森林模型评分（Random forests,RF）及支持向量机评分（Support vector machine,SVM）分别为 0.51,0.65;Grm1 与 Fus 结合的 RF、SVM 评分分别为 0.75,0.97。提示 circ-Grm1、Grm1 可能与 Fus 结合。2.2 RIP实验和下拉实验证实circ-Grm1与PASMCs中的Fus高度结合。3.Circ-Grm1与Fus结合抑制Grm1 mRNA稳定性和表达。3.1 Circ-Grm1与Fus结合抑制Grm1 mRNA稳定性。3.1.1 QRT-PCR证实转染si-Fus后,Fus的表达下调（**P＜0.01）;转染Fus过表达质粒后,Fus的表达上调（**P＜0.01）,证实转染有效。3.1.2与对照组相比,circ-Grm1敲降后,PASMCs中Grm1 mRNA的降解率减少（**P＜0.01）;Fus敲降后,PASMCs中的Grm1 mRNA的降解率明显增加（**P＜0.01）。证实circ-Grm1与Fus结合抑制Grm1 mRNA的稳定性。3.2 Circ-Grm1与Fus结合可抑制Grm1 mRNA表达。Fus过表达后PASMCs中Grm1的表达显著增加（**P＜0.01）。提示Fus的表达与Grm1的表达呈正相关。Circ-Grm1敲降后,PASMCs中Grm1的表达显著提高（**P＜0.01）。Si-circ-Grm1+si-Fus 共转染组与 si-circ-Grm1 组相比,Grm1的表达显著降低（**P＜0.01）,以上结果提示circ-Grm1与Fus结合抑制Grm1 mRNA的表达。4.Grm1可逆转circ-Grm1对PASMCs增殖、迁移的促进作用。4.1 QRT-PCR证实和对照组相比,转染Grm1过表达质粒后,Grm1的表达明显上调（**P＜0.05）;转染circ-Grm1过表达质粒后,circ-Grm1的表达明显上调（**P＜0.05）;证实转染有效。4.2 WB发现与对照组相比,circ-Grm1过表达组Grm1的表达明显下降（**P＜0.05）;与circ-Grm1过表达组相比,circ-Grm1和Grm1同时过表达组Grm1表达明显增加（**P＜0.05）;4.3 CCK-8、EdU分析显示与circ-Grm1过表达组相比,同时过表达circ-Grm1 和 Grm1 组的细胞增殖能力受到抑制（**P＜0.01）。划痕细胞实验、Transwell实验表明circ-Grm1过表达后PASMCs的迁移能力显著增强（**PP＜0.01）,同时过表达circ-Grm1和Grm1后PASMCs的迁移能力显著下降（**P＜0.01）。WB显示细胞迁移相关蛋白MMP2、MMP9,增殖相关蛋白cyclinA、PCNA、CDK-1、Ki67在circ-Grm1过表达后显著增加（**P＜0.01）,而在circ-Grm1和Grm1同时过表达后显著下降（**P＜0.01）。提示Grm1可逆转circ-Grm1对缺氧PASMCs的增殖和迁移的促进作用。5.Circ-Grm 1通过恶性疟原虫的棒状体缔合蛋白-1（Rhoptry-associated protein 1,Rap 1）/细胞外信号调节激酶 1（Extracellular signal-regulated kinase l,ERK1）通路调节Grm1表达。5.1 KEGG分析显示Rap1信号通路富集性最高。5.2 WB结果表明,缺氧组Grm1和Rap1b的表达低于常氧组,而与oe-circ-Grm1组相比,过度表达Grm1的细胞中Grm1和Rap1b的表达明显升高（**P＜0.01）。相反,缺氧组的ph-ERK1表达高于对照组,而Grm1过度表达的细胞ph-ERK1 表达显著低于 oe-circ-Grm1 组（**P＜0.01）。此外,oe-circ-Grm1 和 p-Grm1的共转染逆转了 Grm1过表达对Grm1,Rap1b和ph-ERK1表达的影响。结论:1.Circ-Grm1在缺氧PASMCs中高表达;Circ-Grm1可促进缺氧PASMCs的增殖、迁移。2.Circ-Grm1与RNA结合蛋白Fus结合抑制Grm1 mRNA的稳定性和表达。3.Grm1逆转circ-Grm1对缺氧PASMCs增殖、迁移的促进作用。4.Circ-Grm1与Fus结合通过调控Rap1/ERK1信号通路抑制Grm1的表达,促进缺氧PASMCs的增殖和迁移。