研究背景:肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均位居前列。据统计,肺癌死亡病例数约占所有肿瘤相关死亡的18.4%,其中非小细胞肺癌（Non small-cell lung cancer,NSCLC）约占86%。近年来,由于人口老龄化程度进一步加剧,肺癌发病率呈持续上升趋势。吸烟及空气污染是导致肺癌的重要危险因素,其它危险因素包括职业暴露、遗传及肺部慢性疾患病史等。在我国,肺癌的发病率及死亡率均位居首位,严重威胁人民群众健康。对于早期肺癌,外科手术切除是首选的治疗措施。但肺癌确诊时多数已处于晚期,据统计,只有约19%的肺癌患者能够得到早期诊断。对于失去手术机会的中晚期肺癌,放疗是重要的治疗方法之一,其主要包括体外放射治疗（External beam radiotherapy,EBRT）以及近距离放射治疗（Brachytherapy,BT）。EBRT目前被广泛用于肺癌的治疗,特别是对于不能耐受手术或者拒绝手术的早期肺癌患者,立体定向体部放射治疗（Stereotactic body radiation therapy,SBRT）被认为是一种存在潜在治愈可能的替代方案。BT是一种特殊的放疗形式,它是将放射源直接精确地放置在肿瘤内或肿瘤旁,达到治疗肿瘤的目的。放射性粒子植入术属于内照射治疗范畴,可实现对肿瘤的精准、靶向、适形治疗,在临床上广泛用于头颈部、胸部、骨盆、脊髓的原发性、继发性和复发性肿瘤,特别是在肺癌治疗方面,BT显示出良好的前景,得到越来越多的重视。BT的主要优势在于,它克服了外照射中胸部关键器官（如肺、支气管和脊髓）的剂量限制,在靶区外辐射剂量迅速下降。大量的临床研究表明应用BT治疗非小细胞肺癌,可以改善肿瘤的局部控制,延长肺癌患者的生存时间。在我国,碘125粒子是BT最为常用的放射源,其照射形式为低剂量率持续照射,半衰期长达59.6天。碘125粒子在衰减过程中可发射能量为27～35keV的γ射线,使肿瘤细胞DNA合成受到干扰,达到杀伤并控制肿瘤生长的目的。碘125粒子在组织内的有效作用距离约为20mm,可以实现靶区内高剂量而周围器官受照射影响较小这一目的。既往研究表明,碘125粒子植入治疗肺癌具有高度适形性,疗效确切。但其作用机制尚待进一步明确。近年来,天然药物的抗肿瘤作用受到越来越多的关注。中医药是中华民族的传承瑰宝,振兴中医药事业是国家战略。科技的进步使中医辨证从方剂深入到中药有效成分的探究,深入到细胞、基因层面。许多传统中药具有强大的抗肿瘤作用,可显著抑制肿瘤生长,且副作用较小。野黄芩苷（Scutellarin,SCU）是一种黄酮类化合物,又名灯盏花乙素,可从黄芩、半枝莲、白花蛇舌草等传统中药内提取。SCU在多项实验研究中被证实对包括胃癌、肠癌、肺癌在内的多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用,其可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,增加化疗药物的敏感性,但其是否可能增加放疗的敏感性,特别是增加碘125粒子治疗肺癌的疗效,二者通过何种途径起作用,其具体机制目前尚不清楚。为了研究SCU作用于肺癌细胞的可能通路,课题组首先应用SCU处理肺癌细胞,然后通过蛋白提取、酶切、液相色谱-质谱串联分析、生物信息分析探究处理组与对照组之间的差异表达蛋白,质谱分析结果显示两组之间AKT、mTOR表达存在明显差异。AKT/mTOR信号通路在包括肝癌、肺癌等多个恶性肿瘤中被过度激活,是恶性肿瘤治疗的重要靶点。活化的AKT/mTOR通路涉及到肿瘤细胞存活、增殖、侵袭、转移等诸多恶性生物学行为。研究发现,抑制AKT/mTOR通路可诱导NSCLC细胞凋亡,抑制其增殖。目前包括依维莫司在内的一些AKT/mTOR抑制剂已被用于肿瘤治疗。基于质谱分析结果及AKT/mTOR通路的功能,我们推断碘125粒子及SCU可能通过调控AKT/mTOR通路影响NSCLC的生物学行为;另一方面,二者均可诱导肺癌细胞凋亡,因此我们推断SCU可能增强碘125粒子的抗肿瘤作用。为了验证以上推断,本课题在人肺癌A549、H1975、H157细胞系及小鼠肺癌异种移植动物模型中通过质谱分析、Western blot、siRNA等技术方法研究了 SCU和碘125粒子对肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并对AKT/mTOR通路在其中的作用进行探讨。研究目的:1、研究SCU对碘125粒子诱导的肺癌细胞增殖抑制作用的影响;2、探讨SCU对碘125粒子诱导的肺癌细胞凋亡作用的影响;3、探索并验证SCU增强碘125粒子抗肿瘤作用的分子机制。研究方法:1.测定SCU对肺癌细胞的半数抑制浓度。应用不同浓度SCU处理肺癌细胞,应用CCK-8测定法检测光密度值,使用GraphPad Prism 6.0软件计算SCU对A549、H1975、H157肺癌细胞株的半数抑制浓度（Inhibitory concentration 50,IC50）。以 IC50 的 10%的作为 SCU的增敏浓度。2.研究SCU对碘125粒子抑制肺癌细胞增殖的影响分别将A549、H1975、H157肺癌细胞分为四组,各设为对照组、单独SCU处理组、单独碘125粒子处理组、SCU+碘125粒子联合处理组。应用CCK-8实验测定各组肺癌细胞处理后72小时内的增殖比率;应用流式细胞仪检测各组细胞周期情况。分别将A549、H1975肺癌细胞分为四组,各设为对照组、单独SCU处理组、单独碘125粒子处理组、SCU+碘125粒子联合处理组。应用EdU染色检测各组肺癌细胞处理后72小时后的增殖情况。3.探讨SCU对碘125粒子诱导肺癌细胞凋亡的影响。分别将A549、H1975、H157肺癌细胞分为四组,各设为对照组、单独SCU处理组、单独碘125粒子处理组、SCU+碘125粒子联合处理组。应用流式细胞仪检测细胞凋亡。分别将A549、H1975肺癌细胞分为四组,各设为对照组、单独SCU处理组、单独碘125粒子处理组、SCU+碘125粒子联合处理组。应用Western blot实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平。4.应用动物实验研究SCU对碘125粒子的增敏作用首先建立裸鼠肺癌A549异种移植动物实验模型,在16只雄性小鼠后肢皮下成瘤成功后,随机平均分成四组,分别设为对照组、SCU治疗组、碘125粒子植入组、碘125粒子植入+SCU治疗组,应用游标卡尺每3天测量并记录肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线,21天后处死小鼠获取标本。比较4组肿瘤体积变化,通过体外动物实验进一步研究SCU对碘125粒子抗肿瘤的增敏作用。5.质谱分析筛选SCU作用于肺癌细胞的潜在通路将A549肺癌细胞分为两组,分别设为对照组和SCU处理组,应用全蛋白4D Label-free定量蛋白质组学筛选差异表达蛋白,从而找到关键调控蛋白与通路6.研究AKT/mTOR通路在SCU增强碘125粒子抗肿瘤中的作用6.1探讨AKT/mTOR通路在SCU增强碘125粒子抗肿瘤中的作用分别将A549肺癌细胞及H1975肺癌细胞分为四组,各设为对照组、单独SCU处理组、单独碘125粒子处理组、SCU+碘125粒子联合处理组。Western blot 检测 AKT/mTOR 途径相关蛋白的表达:mTOR,p-mTOR,AKT,p-AKT。6.2验证AKT/mTOR途径在SCU增强碘125粒子抗肿瘤中的作用将A549肺癌细胞分为三组,分别为对照组、SCU+碘125粒子联合处理组、SCU+碘125粒子+siRNA-mTOR组,应用流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡,进一步验证AKT/mTOR通路在SCU增敏碘125粒子抗肿瘤中的作用。结果:1.SCU对肺癌细胞的半数抑制浓度测定CCK-8实验结果显示SCU可诱导A549、H1975及H157肺癌细胞株凋亡,其诱导凋亡能力与SCU剂量正向相关。测得SCU对A549细胞的IC50值为246.8μg/mL,对H1975细胞的IC50值为120.0μg/mL,对H157细胞的IC50 值为 127.7μg/mL。2.SCU可显著增强碘125粒子对肺癌细胞的增殖抑制作用2.1 CCK-8实验测定各组肺癌细胞处理后72小时内的增殖比率结果表明,单独应用SCU或碘125粒子处理可抑制肺癌细胞的生长,而二者联合治疗可更加显著的抑制肺癌细胞的生长。2.2流式细胞仪检测各组细胞周期情况结果显示,SCU或碘125粒子可使肺癌细胞生长阻滞于G2/M期,使其细胞周期停滞,而二者联合治疗可使肺癌细胞的G2/M期阻滞显著增加。2.3 EdU试验结果显示,经SCU联合碘125粒子处理,处于增殖状态的肺癌细胞数量明显低于应用SCU或碘125粒子单独处理。3.SCU可使碘125粒子诱导肺癌细胞凋亡作用显著增加3.1流式细胞检测结果显示,在A549、H1975及H157三个肺癌细胞系中,碘125粒子联合SCU治疗比二者单独处理时,肺癌细胞凋亡显著增加。3.2 Western blot实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达量显示,联合治疗组与二者单独治疗组比较,联合治疗组Bax表达量显著增高、Bcl-2表达量显著降低。4.动物实验中,SCU可显著增强碘125粒子的抗肿瘤作用。动物实验结果显示SCU和碘125粒子联合治疗组小鼠皮下肿瘤体积较二者单独治疗显著减小。5.质谱分析结果应用4D Label-free定量蛋白质组学技术筛选对照组和经SCU处理的A549肺癌细胞的差异表达蛋白,结果共产生1220388个二级谱图,鉴定蛋白5609个,定量到蛋白4940个,筛选差异表达蛋白共247个。差异蛋白富集分析显示对照组与SCU处理组之间AKT/mTOR信号通路相关蛋白富集显著。6.SCU增强了碘125粒子诱导的AKT/mTOR通路下调,沉默mTOR表达可显著增加SCU和碘125粒子的抗肿瘤作用6.1 Western blot检测结果显示,SCU或碘125粒子处理后,AKT/mTOR通路相关蛋白mTOR,p-mTOR,AKT,p-AKT的表达下调。而经SCU联合碘125粒子处理肺癌细胞后,AKT/mTOR通路相关蛋白的表达下调更加明显。6.2流式细胞检测显示,与SCU+碘125粒子组相比,SCU+碘125粒子+siRNA-mTOR组肺癌细胞凋亡明显增加,G2/M阻滞明显增加。沉默mTOR表达后,SCU和碘125粒子联合抗肿瘤作用明显增强。研究结论:1、SCU可增加碘1 25粒子诱导的肺癌细胞增殖抑制作用;2、SCU可增强碘125粒子诱导的肺癌细胞凋亡作用;3、SCU通过下调AKT/mTOR通路,增强碘125粒子在肺癌中的抗肿瘤作用。研究意义:本项研究发现SCU可通过增强碘125粒子诱导的AKT/mTOR通路下调,增强碘125粒子在肺癌中的抗肿瘤作用,在一定程度上明确了 SCU及碘125粒子治疗肺癌的机制,为二者联合应用治疗肺癌提供了理论基础,为肺癌的临床治疗提供了新的思路。