龋齿,是由多因素引起的牙齿硬组织破坏性慢性疾病。其发病隐匿,患病率高,严重危害人类口腔健康,影响人类生活质量。如不加以治疗,这一常见疾病可引发败血症等严重疾病导致死亡。世界卫生组织将龋齿列为仅次于癌症和心血管疾病的第三位重点防治类非传染性疾病。随着生活质量的提高,人们越来越重视龋齿的预防和治疗。目前龋齿的治疗手段多种多样,如氟化物、封闭剂、抗菌剂和抗生素的投入以及多种天然植物成分和抗菌肽等。然而过去30年未经治疗的龋齿带来的全球负担仍居高不下,且随着世界人口增长和老龄化趋势不断加剧,龋齿造成的负担将持续加重。值得注意的是,目前多种治疗方法均出现不同程度的副作用或者存在潜在风险。因此寻找健康有效的治疗方法,是解决龋齿问题、维护人类健康的重要内容。变形链球菌是引发龋齿的主要病原菌,能够利用口腔中的食物残渣进行发酵,形成生物被膜,附着在牙齿表面,产生牙菌斑,同时产生有机酸,使牙齿表面pH迅速降低,导致牙釉质脱矿,产生龋洞。变形链球菌形成生物被膜是龋齿发生的关键因素。牙菌斑生物被膜结构致密,粘附性强,一旦形成很难清除,附着在生物被膜内部的细菌继续发酵产酸,使病情恶化。胞外多糖（extracellular polysaccharides,EPS）是牙菌斑生物被膜的主要成分。EPS构成生物被膜的骨架,呈网状结构,黏附性强,可将细菌和其他分泌物包裹其中,促进生物被膜内部细菌交流。对外形成屏障作用,抵御外界机械清除和宿主防御,阻止抗菌剂的渗透作用,保护内部细菌免受伤害,提高细菌耐药性,为龋齿的治疗造成严重阻碍。研究人员致力于寻找有效的酶作用于变形链球菌生物被膜,然而效果甚微。变形链球菌生物被膜合成途径中存在一种糖苷水解酶DexA,该酶属于CAZy糖苷水解酶第66家族,被细菌分泌到胞外发挥作用。DexA能够水解生物被膜中α-（1-6）-糖苷键的水溶性葡聚糖,促进水不溶性多糖的合成,提高生物被膜的黏附性,促进生物被膜成熟和发展,加强生物被膜毒性。本论文利用其对葡聚糖的水解活性,截取蛋白核心结构域,得到截短体蛋白DexA70。将DexA70通过外源添加的形式作用于变形链球菌生物被膜,检测到其对变形链球菌生物被膜形成的显著抑制作用,及对已形成的生物被膜的明显水解作用。将DexA70与其他抗菌剂协同作用,可达到更好地清除生物被膜的效果。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1.变形链球菌糖苷水解酶截短体蛋白DexA70能够有效抑制变形链球菌生物被膜形成,对已经形成的生物被膜有明显的水解作用。生物被膜合成关键酶应用于自身生物被膜瓦解,为生物被膜介导的疾病提供新的治疗思路。本研究通过对变形链球菌糖苷水解酶DexA进行结构和功能分析,获得其截短体DexA70（aa100-732）,通过酶活特征检测,发现该截短体与全长蛋白相比性质稳定,不易降解,且对葡聚糖的水解活力更高,该酶最适温度为40℃,最适pH为5.0。外源添加DexA70进行生物被膜培养时,1 nM的DexA70能够减少50%的生物被膜形成,添加浓度为50 nM时几乎完全抑制变形链球菌生物被膜形成。DexA70对变形链球菌细菌生长无影响,对生物被膜的抑制是通过不断水解合成的多糖产生的。将DexA70作用于已经形成的生物被膜时,500 nM的DexA70在30 min可以水解77±2%的生物被膜,与全长蛋白DexA相比,其水解效率大大提高。DexA70对生物被膜的水解作用可以添加到口腔制剂中,应用于龋齿的预防和治疗中。作为变形链球菌生物被膜合成过程中的关键酶,DexA70被用于生物被膜的抑制和水解,为生物被膜相关疾病的治疗提供新的思路,在细菌自身生物被膜合成途径中寻找有效的治疗手段,可能是新的研究方向。2.DexA70与溶菌酶协同作用,在瓦解生物被膜的同时,裂解生物被膜内部的细菌,达到更好的清除效果。溶菌酶是临床治疗中常用的药物成分,具有抗菌、消炎、增强抗生素疗效等作用。研究表明,溶菌酶可以用来治疗由细菌生物被膜引发的多种疾病。本论文研究发现溶菌酶对变形链球菌浮游细胞具有明显的杀菌作用,外源添加能够减少生物被膜的合成,但是对已经形成的生物被膜完全无效,生物被膜的致密性结构导致溶菌酶很难渗透进入生物被膜内部发挥作用。将DexA70与溶菌酶同时作用于变形链球菌生物被膜,DexA70的水解作用破坏生物被膜,利于溶菌酶渗透,裂解生物被膜内部的细菌。通过激光共聚焦显微镜观察发现,DexA70作用之后的生物被膜厚度变薄,生物被膜表面完整性被破坏,出现较多孔洞,与溶菌酶同时作用之后,生物被膜受到更大程度的破坏。500 nM的DexA70与2 mg/mL溶菌酶作用于生物被膜之后,对生物被膜的清除率达84.2±2.4%。对生物被膜三维结构进行定量分析发现,生物被膜生物量、平均扩散距离减少90%左右。酶作用之后,生物被膜的表面积体积比显著增加,表明生物被膜表面变得凹凸不平,与外界接触面积变大,更易受到外界环境变化的干扰,提高了生物被膜细菌敏感性。通过死活细胞染色法和菌落计数法探究了不同处理状态下生物被膜内部细菌生物量的变化。结果显示,DexA70与溶菌酶协同作用之后,生物被膜内部活菌数明显减少。DexA70与溶菌酶协同作用,瓦解变形链球菌生物被膜结构,使溶菌酶渗透进入生物被膜内部,破坏了生物被膜的屏障作用,降低了生物被膜细菌耐药性,起到更有效的杀菌作用。3.DexA70与溶菌酶联合作用可以有效瓦解釉质片生物被膜,应用于大鼠龋病模型能有效抑制大鼠龋病发展。我们利用人离体釉质片培养人工获得性膜,进而形成生物被膜,更真实地检测了 DexA70与溶菌酶对生物被膜的作用。研究结果表明,DexA70对变形链球菌生物被膜有较大程度的水解作用,溶菌酶联合作用之后,对生物被膜的清除能力显著提高。随后利用大鼠口腔龋病模型,研究了 DexA70与溶菌酶协同作用对大鼠龋齿发展的影响,研究结果表明,DexA70与溶菌酶联合作用,能够抑制大鼠口腔生物被膜的形成,对大鼠口腔内已经形成的生物被膜有明显的水解作用,能有效抑制大鼠龋病的发展。实验期间各组大鼠生长状况良好,体重稳定增长,精神状态无明显差异。对大鼠进行解剖学观察,发现其心、脑、肝脏、肾脏均无明显异常,表明实验期间DexA70与溶菌酶联合作用对大鼠无明显不良影响。两种酶的协同作用对龋病发展有明显抑制作用,不会引起细菌耐药性增强,对机体无明显的副作用,在龋齿的治疗中具有很好的应用前景。4.DexA70与氯己定和西吡氯铵协同作用,通过破坏生物被膜结构完整性提高了生物被膜细菌敏感性,降低了抗菌剂的有效作用浓度。氯己定和西吡氯铵是口腔护理产品中的主要抗菌剂成分,具有广谱抗菌作用。但是抗菌剂的添加浓度远远高于细菌的耐受浓度,过量使用会引发多种副作用,如牙齿着色、味觉消失、干扰共生微生物群,增强细菌耐药性,因此治疗效果不佳。本论文验证了生物被膜的存在使变形链球菌对氯己定和西吡氯铵的耐受浓度提高上千倍的现象,证明抗菌剂对生物被膜状态的细菌很难发挥作用。DexA70作用于生物被膜之后,生物被膜结构被破坏,对抗菌剂的渗透性明显提高。将DexA70抗生物被膜作用与抗菌剂抗菌作用结合,添加500 nM DexA70作用于生物被膜之后,抗菌剂的最小生物被膜清除浓度（MBEC）和最小生物被膜抑制浓度（MBIC）都有所下降。DexA70水解生物被膜之后,生物被膜内部细菌暴露,对抗菌剂的敏感性增强,抗菌剂更容易发挥抗菌作用。由于DexA70与抗菌剂联合使用可以达到协同作用效果,将DexA70添加到口腔护理产品中可以减少抗菌剂的使用浓度,减少副作用的产生,是—种预防龋病发展的新策略。5.提出生物被膜耐药性检测新方法——最小生物被膜活细胞清除浓度（MBVEC）,提高生物被膜耐药性检测灵敏度。目前常用的生物被膜耐药性检测方法包括最小生物被膜清除浓度（MBEC）和最小生物被膜抑制浓度（MBIC）,指的是生物被膜在接受抗菌剂挑战之后复苏再次生长的药物浓度。但是由于细菌生物被膜的存在,药物作用之后会与多糖基质结合,很难清除干净,因此会影响后续的实验结果。本研究提出最小生物被膜活细胞清除浓度,是在抗菌剂作用之后将生物被膜全部打散,通过稀释涂布的方式将细菌涂布在固体平板上,再通过菌落计数检测抗菌剂作用效果。这种方式能够完全反映生物被膜内部活细胞的实际情况,免受其他因素的干扰。通过此方法检测DexA70与抗菌剂协同作用,显示出生物被膜细菌对抗菌剂的耐受浓度远远高于通过传统方法检测到的结果。DexA70作用后,氯己定的MBVEC降低5倍,西吡氯铵的MBVEC降低10倍,检测效果比MBIC和MBEC更明显。综上所述,本论文研究了糖苷水解酶DexA70在变形链球菌生物被膜抑制和水解中的应用。DexA70可以瓦解变形链球菌生物被膜,破坏生物被膜结构。DexA70与溶菌酶协同作用,对生物被膜有更好的清除效果,对大鼠龋病的发展有明显的抑制作用。DexA70能够提高生物被膜渗透性,降低抗菌剂的使用浓度,减少细菌耐药性的产生。生物酶制剂应用于生物被膜相关疾病治疗,可以减少副作用,为龋齿的预防和治疗提供新的治疗策略。