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【研究背景及目的】在各种病因所导致的肝损伤中,机体免疫介导所致肝细胞损伤占有重要的地位,尽管具体机制复杂,但免疫细胞的活化均是其始动因素。本研究室的前期数据首次阐述了NK细胞在病毒诱导的重度肝细胞损伤中至关重要。通过对比研究重型乙型肝炎和轻中度慢性乙型肝炎患者的基因表达谱,发现钾离子通道相关基因KCTD9的表达与疾病的严重程度即肝损伤的程度高度正相关,在重型肝炎患者淋巴细胞胞核中该分子高度表达。进一步发现其表达主要在重型肝炎患者肝组织和外周血NK细胞。初步体外实验结果的显示,该分子的高表达与NK细胞的活化和功能具有紧密联系[1-3]。通过生物信息学分析发现,该分子与新型接头蛋白SHB分子具有紧密功能关联,而SHB分子与IL-2受体信号途径和PI3K途径相关[4]。据此我们提出KCTD9分子可能是NK免疫细胞活化过程中的关键分子之一,并可能通过SHB蛋白参与免疫细胞活化过程。本研究针对KCTD9和SHB基因构建相对应的标签质粒,通过体外实验验证KCTD9分子和SHB分子之间是否存在功能关联,为进一步揭示NK细胞及其表达的KCTD9分子在重型乙型肝炎肝损伤发生和发展中的作用及其作用机制奠定基础。【研究方法】利用分子克隆技术构建在氨基端含有His标记的His-KCTD9融合蛋白载体pHis-KCTD9和在氨基端含有FLAG标记的FLAG-SHB融合蛋白载体pFLAG-SHB,采用HEK293T细胞、jurkat细胞及NK92细胞共转染和免疫共沉淀法验证KCTD9与SHB分子的相互作用。【研究结果】成功构建了氨基端含有His标记的His-KCTD9融合蛋白载体pHis-KCTD9和在氨基端含有FLAG标记的融合蛋白FLAG-SHB的载体pFLAG-SHB。成功共转染HEK293T细胞、jurkat细胞及NK92细胞后,采用免疫共沉淀法发现KCTD9与SHB分子无结合。【研究结论】成功构建了pHIS-hKCTD9和pFLAG-hSHB真核表达质粒,通过体外实验初步推断:KCTD9蛋白与SHB蛋白之间不存在直接相互作用。鉴于此KCTD9究竟是通过与哪一种蛋白分子的相互作用发挥其免疫学功能值得进一步研究。