【摘 要】
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伏马毒素（Fumonisins,FB）是镰刀菌属等真菌在特定条件下产生的一种次级代谢产物。伏马毒素B1（FB1）是在自然界污染范围最广毒性最强的一类伏马毒素,它可以造成猪的肺水肿、啮齿类动物的肝癌和肺癌、乃至人类肝癌和肺癌等癌症。目前,全球范围内的粮食作物每年都会遭受不同程度伏马毒素污染,如何高效去除饲料及粮食作物中的FB1成为亟待解决的问题。目前生物酶法已被证实是去除伏马毒素污染的有效途径,但是
【基金项目】
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国家级创新型科研项目； 天津市高等学校创新团队培养计划资助“TD13-5015”；
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伏马毒素（Fumonisins,FB）是镰刀菌属等真菌在特定条件下产生的一种次级代谢产物。伏马毒素B1（FB1）是在自然界污染范围最广毒性最强的一类伏马毒素,它可以造成猪的肺水肿、啮齿类动物的肝癌和肺癌、乃至人类肝癌和肺癌等癌症。目前,全球范围内的粮食作物每年都会遭受不同程度伏马毒素污染,如何高效去除饲料及粮食作物中的FB1成为亟待解决的问题。目前生物酶法已被证实是去除伏马毒素污染的有效途径,但是国内外对伏马毒素解毒酶的研究仍然匮乏。本文主要利用序列分析、基因工程和定点突变等方法,获得了 3个可有效降解伏马毒素的新的伏马毒素解毒酶,并进行了多个宿主异源表达、对酶学性质和催化机制展开了研究,为减少饲料行业中伏马毒素的危害提供了有力的理论依据,具有产业应用潜力。主要内容如下:（1）首先,对已报道伏马毒素解毒酶FumD和9个潜在的伏马毒素解毒酶基因在大肠杆菌中进行异源表达。纯化后的重组蛋白经高效液相色谱检测后发现FumD、Fum37、Fum53、Fum56在30 min和37℃条件下可以完全降解1 μg的FB1。由于Fum37、Fum53、Fum56的氨基酸序列与已报道伏马毒素解毒酶FumD的一致性仅约为45%,说明它们是新的伏马毒素解毒酶。然后对FumD和3个伏马毒素解毒酶Fum37、Fum56、Fum53进行了诱导条件优化:FumD的最适诱导条件为25℃,8 h,IPTG 1 mM;Fum37的最适诱导条件为25℃,20 h,IPTG 1 mM;Fum56的诱导温度为30℃,20 h,0.6 mM;Fum53最适诱导条件为25℃,20h,0.2 mM;（2）进一步尝试了 4个伏马毒素解毒酶FumD和Fum37、Fum56、Fum53在毕赤酵母中的异源表达,经检测都具有伏马毒素降解活性。通过诱导时间进行了发现,Fum37、Fum56和Fum53最佳诱导时间都为48 h。（3）通过酶学性质分析发现:Fum37的最适反应温度为37℃,最适pH为9;Fum53的最适反应温度为30℃,最适pH为9;Fum56的最适反应温度为30℃,最适pH 6;金属离子对3个酶的催化活力表现出不同的影响效果,Na+对Fum37的酶活有一定促进作用（110%）;Ca2+和Na+对Fum56的酶活有显著抑制作用（分别为67.1%和76.1%）;Mg2+、K+和Na+对Fum53的活力具有显著促进作用（分别为110%、120%和 130%）。（4）为了进一步研究Fum37的催化机制,采用定点突变方法构建了 Fum37的3个突变体S194A、E311A和H406A,并在大肠杆菌中成功表达。通过高效液相色谱检测发现3个突变体完全丧失了伏马毒素解毒活性,初步说明S194、E311和H406这三个氨基酸位点是Fum37的关键催化氨基酸位点,为后续解析伏马毒素解毒酶的蛋白结构和催化机制奠定基础。
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