砂梨ACS基因鉴定及其在果实成熟中的功能解析

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砂梨是我国梨主要栽培种,货架期短、不耐贮藏是制约其产业发展的“瓶颈”之一。前期研究显示,不同品种果实成熟过程中乙烯释放量存在显著差异,即同时存在呼吸跃变型和非呼吸跃变型品种类型。因此,除采后技术之外,不同品种自身呼吸跃变类型对其贮藏性的影响更为关键;明晰砂梨果实成熟机理、选育耐贮藏砂梨新品种是从根本上解决该问题的有效途径。砂梨果实采后乙烯释放量是影响其贮藏性的关键因素,ACS是乙烯合成的限速酶。本研究以早熟低乙烯砂梨品种‘鄂梨2号’和早熟高乙烯砂梨品种‘二宫白’为试材,通过转录组测序和表达分析探讨了砂梨ACS基因家族不同成员在不同跃变型砂梨品种果实成熟过程中的表达模式,明晰了调控不同跃变型砂梨品种乙烯生成的关键ACS家族成员,研究结果可望为砂梨果实成熟调控提供科学依据。主要结果如下:1.不同砂梨种质果实成熟特征分析。通过对26份砂梨种质果实发育期、货架期、可溶性固形物含量、果肉硬度、果实乙烯释放量等测定分析,发现不同品种货架期乙烯释放量峰值在0.1-214.4μL·kg-1·h-1,其中早熟品种乙烯释放量普遍较高,表现为呼吸跃变型特征,而中晚熟品种砂梨果实货架期间的乙烯释放量普遍较低,表现为非呼吸跃变型特征。不同品种的果实发育期与果实货架期存在极显著正相关,与乙烯释放量存在极显著负相关。果实货架期与其乙烯释放量存在极显著负相关。发掘出特异种质两份即早熟非跃变型种质‘鄂梨2号’和晚熟跃变型种质‘金水1号’。2.ACS基因家族鉴定。通过全基因组筛选,从砂梨、白梨、西洋梨、苹果和桃等蔷薇科5个物种的基因组中共鉴定ACS基因56个:苹果13个、砂梨13个、西洋梨12个、白梨10个和桃8个。系统进化模式分析表明全基因组复制(WGD)是ACS基因家族扩张的主要驱动力。同属苹果亚科(Maloideae)的砂梨、白梨、西洋梨和苹果的ACS基因数量大致相当,约为桃的2倍,可能与桃未发生近代全基因组复制事件有关。ACS蛋白序列聚为4组,与ACS分类结果吻合。Putative AAT型ACS最为原始,且其数量最为保守。砂梨中鉴定到的13个PpyACSs中的9个为本研究首次报道。染色体定位及共线性分析结果显示15号染色体上分布的ACS基因最多且分布有最为关键PpyACS1和PpyACS2,因此该区段可能是砂梨果实成熟乙烯生成调控关键区域;亚细胞定位预测及实验证实除TypeⅡ型ACS定位于细胞质中外,其余PpyACSs均定位于叶绿体。启动子顺式元件预测发现,PpyACSs启动子区存在大量的激素和逆境响应元件。组织特异性表达分析表明PpyACSs主要在成熟果实和花中表达。3.ACS在砂梨不同跃变型果实发育成熟过程中的表达分析。以跃变型品种‘二宫白’和非跃变型品种‘鄂梨2号’成熟前后的果实为试材,通过RNA-seq和qRT-PCR分析表明,差异表达基因主要富集到植物激素响应通路,且在跃变型品种高于非跃变品种,果实成熟后高于成熟前;砂梨ACS基因家族中有7个成员参与果实成熟过程,其中5个为首次报道;PpyACS8、PpyACS12和PpyACS13负责果实成熟前乙烯生成,而果实成熟后的乙烯生成主要由PpyACS1、PpyACS2、PpyACS3和PpyACS9负责,其中PpyACS1主要负责高乙烯品种果实系统2跃变乙烯生成;PpyACS2、PpyACS3负责砂梨中低乙烯品种果实成熟采后的乙烯生成。4.ACS1启动子克隆和测序分析。对18个不同乙烯释放能力梨品种ACS1启动子克隆和测序分析发现,西洋梨ACS1起始密码子上游-855 bp处均有一段285 bp的插入片段,东方梨中高乙烯品种和低乙烯品种分别具有相同的启动子序列。鉴定到ABRE、G-box、ARE、TCA-element、WUN-motif和TCT-motif等6个激素和逆境响应等类型顺式作用元件变异与其乙烯释放能力存在相关性。综上所述,本研究通过全基因组筛选鉴定明确了砂梨及蔷薇科及其它4个近缘种的ACS基因家族信息,其中砂梨ACS基因家族13个成员中的9个为首次报道。通过砂梨种质资源筛选鉴定到一份早熟低乙烯特异种质‘鄂梨2号’并以此为试材,明晰了砂梨ACS基因家族及其在不同跃变型果实发育成熟不同阶段的表达模式。此外,本研究还发现一直被认为不具有ACS酶活性的Putative AAT型ACS基因数量高度保守且参与了砂梨乙烯合成,因此今后该类ACS应被归为ACS家族中重要一类而受到重视。
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