背景与目的:糖尿病（DM）的患病人数在世界范围内以惊人的速度不断增加。据统计,2021年全球有5.37亿成年人患有这种疾病。其中,90%的糖尿病患者为2型糖尿病。糖尿病肾病（DKD）是糖尿病累及肾脏所产生的疾病,在我国的发病率呈现上升趋势,已成为当今世界终末期肾病（ESRD）的首要原因。DKD临床以微量蛋白尿到大量蛋白尿伴随肾功能损害为特征,而肾小球足细胞是肾小球电荷屏障的重要组分之一,起着调节肾小球滤过功能的重要作用。探究足细胞的受损机制对于DKD的治疗有着重要意义,寻找关键治疗靶点对疾病的防治有着较大的研究空间。传统中药（TCM）在中国已有数千年的历史,中药更是被广泛用于糖尿病及其并发症的治疗。随着中药治疗DKD的疗效及作用机制研究的深入,中药可能在缓解蛋白尿方面发挥重要作用。吴茱萸次碱（Rutaecarpine）是中药吴茱萸的一种重要活性成分,在抗炎症治疗方面有着大量报道。因此吴茱萸次碱可作为多种疾病的潜在治疗药物。课题组前期研究结果显示,吴茱萸次碱（Rut）在肾脏疾病中有良好的保护作用。本课题旨在探究吴茱萸次碱能否改善糖尿病肾病肾脏损伤,以及其具体作用机制,为治疗糖尿病肾病的药物开发提供新思路。方法:体内实验:使用db/db小鼠（C57BLKS/J db/db）模拟2型糖尿病肾病,模型治疗组分别进行12周吴茱萸次碱灌胃治疗,每两周检测记录一次小鼠体重及血糖变化。该实验分为六组（n=6-8）:db/m对照组,单独灌药组（Rut）,db/db模型组,模型治疗组（db/db+Rut5、10、20mg/kg）。12周后检测小鼠一般指标和病理学变化,24h尿蛋白定量,以及观察足细胞损伤指标。HE、PAS、透射电镜染色观察各组肾小球形态学变化。通过免疫组化和（或）Western blot检测糖尿病小鼠肾小球中足细胞损伤标志物蛋白表达变化（nephrin/podocin/WT-1）,检测炎症炎症指标的表达及活化程度（NLRP3/ASC/IL-18/IL-1β）;实时荧光定量PCR检测炎症因子m RNA表达水平的变化（IL-18/IL-1β）;Western blot,免疫组化,实时荧光定量PCR技术检测焦亡相关蛋白的活化、表达情况（caspase-1/GSDMD）。体外实验:选取小鼠足细胞（MPC5）作为实验对象。运用MTT实验筛选出吴茱萸次碱药物毒性以及药物最适浓度。实验分为七组:正常组,甘露醇组,正常+吴茱萸次碱组,高糖组,高糖+不同剂量吴茱萸次碱组（0.25μM、0.5μM、1μM）。通过免疫荧光和Western blot实验检测细胞损伤（nephrin/podocin）;Western blot和（或）实时荧光定量PCR技术检测炎症因子的表达（NLRP3/ASC/IL-18/IL-1β）;Western blot和实时荧光定量PCR技术检测焦亡参与蛋白的活化及含量（caspase-1/GSDMD）;TUNEL试剂盒检测细胞程序性死亡水平。运用Dicovery Studio软件进行药物靶点预测,评选出药物最有潜力的作用靶点VEGFR2;采用分子对接、热位移（CESTA）实验以及表面等离子共振法（SPR）加以验证药物与靶点是否可以结合以及结合的作用模式和稳定性;同时,我们运用免疫共沉淀（co-ip）验证了药物靶点蛋白与下游信号通路蛋白NLRP3的结合。Western blot实验检测各组小鼠肾脏组织及MPC5细胞中VEGFR2的表达;通过转染实验沉默MPC5细胞中的靶点蛋白（VEGFR2）,再运用Western blot以及实时荧光定量PCR技术检测作用靶点沉默成功后,药物对MPC5胞损伤、炎症、焦亡反应指标的影响。结果:体内实验:生化指标提示,经吴茱萸次碱治疗后可以显著逆转db/db2型糖尿病小鼠的肾功能减退;HE、PAS染色、透射电镜显示吴茱萸次碱治疗后db/db糖尿病小鼠的肾脏的病理学特征如肾小管扩张、系膜区扩张增生、足突宽度、基底膜厚度都有所改善;Western blot和免疫组化实验结果均提示db/db糖尿病小鼠肾脏中nephrin/podocin/WT-1表达量下降,而吴茱萸次碱可以上调这些指标;同样,实时荧光定量PCR和（或）Western blot、免疫组化实验提示db/db糖尿病小鼠肾脏中高表达的NLRP3/ASC/IL-18/IL-1β经吴茱萸次碱治疗后有所缓解;Western blot和（或）实时荧光定量PCR、免疫组化实验同样提示经吴茱萸次碱治疗后糖尿病小鼠的caspase-1/GSDMD表达水平被显著遏制。且上述指标均对吴茱萸次碱呈药物依赖性上调或下降。体外实验:MTT法显示,吴茱萸次碱有效浓度分别为0.25u M、0.5u M、1u M。Western blot和免疫荧光表明吴茱萸次碱可以上调高糖诱发的足细胞标记物nephrin/podocin蛋白的低表达;Western blot和实时荧光定量PCR实验结果提示高糖组NLRP3/ASC/IL-18/IL-1β与正常组相比表达水平与活化程度明显上升,而吴茱萸次碱干预后可以抑制这些炎症因子的表达;Western blot和Real-time PCR实验结果同样提示高糖组吴茱萸次碱遏制caspase-1/GSDMD含量及活化水平;TUNEL染色结果提示吴茱萸次碱可以减轻高糖组高发的细胞程序坏死。生物信息学,分子对接实验,CESTA及SPR实验均证实了VEGFR2为吴茱萸次碱的潜在作用靶点;同时,免疫共沉淀（Co-ip）结果显示,VEGFR2与NLRP3可以直接结合。Western blot实验结果也提示吴茱萸次碱可以下调体内实验模型组小鼠肾脏及体外实验高糖组MPC5细胞中VEGFR2的高表达;验证VEGFR2沉默成功后,Western blot及实时荧光定量PCR实验结果提示高糖所造成的MPC5损伤有所缓解,但药物无法再进一步发挥其对MPC5细胞的保护作用。因此我们证明了吴茱萸次碱通过VEGFR2/NLRP3依赖途径发挥作用。结论:（1）体内实验显示:吴茱萸次碱有效缓解了db/db 2型糖尿病小鼠的肾脏损伤,抑制肾脏炎症、焦亡反应。（2）体外研究显示:吴茱萸次碱可以有效阻止高糖诱发的足细胞受损,以及细胞炎症、焦亡反应。（3）多种药理学分析方法显示:吴茱萸次碱可以通过靶向VEGFR2发挥作用。Co-ip提示吴茱萸次碱可通过VEGFR2/NLRP3依赖性通路对db/db2型糖尿病小鼠的足细胞损伤起保护作用。