目前世界上每年有150万婴幼儿因需进行外科手术或介入治疗等多种原因而接受全身麻醉。长期以来，全身麻醉是否影响婴幼儿的智力发育一直是患儿亲属十分关注的问题，并往往因这种顾虑而耽误了最佳手术治疗时机。至今为止，国内外对此问题还没有进行深入系统的研究，因而麻醉药物对婴幼儿智力发育的影响成为了目前待解决而又未有明确答案的问题。 婴幼儿处于脑发育的关键时期，中枢神经系统的可塑性很大，易受内外环境的影响，这为证实麻醉药是否作用于婴幼儿的大脑而影响智力发育提供了理论上的可能性。氯胺酮是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，具有起效快、镇痛效果好及作用时间短等优点，在婴幼儿麻醉中应用广泛。近年的研究表明，在脑发育的关键期短暂的使用NMDA拮抗剂可诱发新生鼠多个重要脑区大量神经元发生凋亡，并可对成年期的行为学和认知功能产生重大的影响。乙醇既是NMDA受体的拮抗剂，又是GABAA受体的激动剂。目前有大量的研究指出，孕妇过度服用乙醇，可造成胎儿海马和其它脑区神经元凋亡，导致胎儿酒精综合症，表现为行为异常、学习能力下降等精神疾患。氯胺酮作为NMDA受体的拮抗剂的一种，作用于婴幼儿的大脑，是否也有相似的作用呢?目前尚不明确。 细胞的凋亡常常受抑凋亡基因及促凋亡基因的控制，Bax和Bcl-2是和凋亡密切相关的基因，在中枢神经系统的发育过程中起着重要作用，并且在海马等多个脑区中表达量很丰富。氯胺酮如果对未成熟大脑神经元凋亡有影响，是否是通过Bax和Bcl-2基因表达的改变而发挥作用?目前这方面的研究少见。 本实验在体外分离培养大鼠海马神经元细胞的基础上，观察不同浓度的氯胺酮对大鼠海马神经元凋亡的影响，从细胞存活率、细胞形态学、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达等方面对氯胺酮损伤海马神经元的过程及机理进行探讨，为进一步的分子机制等研究提供依据。 实验方法 1.海马神经元原代培养：选用妊娠18d的SD大鼠的胎鼠，分离海马组织，机械吹打法分离成单细胞悬液，接种于24孔板。3～6hr细胞贴壁后换成无血清培养基(DMEM/F12+2％B27)。 2.实验设计：实验设计采用完全随机化设计，分析研究不同浓度的氯胺酮对体外培养5d的大鼠海马神经元凋亡的影响。 2.1实验分组将体外培养5d生长良好的海马神经元，随机分成以下5组进行实验。对照组：正常培养，未作处理，但与实验组同时换液0.1uM组：加入氯胺酮使其终浓度0.1uM(uM为umol/L的简写)1uM组：加入氯胺酮使其终浓度为1uM10uM组：加入氯胺酮使其终浓度为10uM20uM组：加入氯胺酮使其终浓度为20uM以上5组在上述处理后培养24hr，之后全量换培养液(2％B27+DMEM/F12)，继续培养24hr后观察各指标的变化。 2.2主要检测指标 (1)MTT、FDA染色检测氯胺酮对海马神经元存活率的影响；台盼蓝染色鉴别海马神经元的坏死与凋亡。 (2)光学显微镜下对氯胺酮处理后的神经元进行形态学观察； (3)Hoechst33258核染色及TUNEL法检测细胞凋亡情况； (4)免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达情况，以探讨氯胺酮诱导凋亡的相关机理。 每组在每次实验中均设至少4个孔，对每次实验均行3次独立的细胞培养进行重复，以避免不同次的细胞培养造成实验结果的差异。 统计学分析所有计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS11.0版统计学软件，采用方差分析法进行检验，各处理组与对照组间的比较采用DUNNETT过程，各组间两两比较采用S-N-K过程。以P＜0.05作为差异有显著性。 实验结果： 1.海马神经元的培养及鉴定：取培养5d的细胞，进行微管结合蛋白2(MAP2)抗体免疫组化染色鉴定。显微镜下，胞浆、轴突和树突呈棕褐色或棕黄色的细胞为神经元，结果显示神经元纯度在90％以上。 2.氯胺酮对海马神经元存活率的影响氯胺酮处理后，MTT及FDA染色结果均显示，0.1uM、1uM组细胞存活率略有降低，但与对照组无差异；而10uM、20uM组的神经元存活率明显降低(p＜0.001)。台盼蓝染色结果显示各组的细胞坏死比例无差异。 3.氯胺酮对海马神经元凋亡发生的影响3.1形态学观察倒置相差显微镜下观察各组神经元。0.1uM、1uM组的神经元与对照组无差异。10uM、20uM组的海马神经元，见细胞胞体缩小，胞浆浓缩，细胞核固缩，神经元突起中断，呈典型的凋亡形态学改变。 3.2细胞凋亡检测结果分析Hoechst33258染色及TUNEL染色均显示0.1uM、1uM组细胞凋亡比例与对照组无差异。而10uM、20uM组细胞凋亡比例明显增高(p＜0.001)，20uM组细胞凋亡比例高于10uM组(p＜0.05)。 4.氯胺酮对Bcl-2及Bax蛋白表达的影响免疫细胞化学染色法发现，10uM、20uM氯胺酮处理后，与对照组比较，Bax蛋白的表达水平明显上调(p＜0.001)，而20uM组Bax蛋白OD值高于10uM组(p＜0.05)；Bcl-2蛋白水平则下调(p＜0.001)，20uM组Bcl-2蛋白OD值低于10uM组(p＜0.05)。0.1uM、luM组的Bcl-2、Bax蛋白表达与对照组相比无显著性差异。 结论： 1.氯胺酮在一定的浓度范围内(≥10uM)可明显地诱导大鼠胎鼠海马神经元凋亡，并与剂量有关。 2.Bcl-2及Bax蛋白表达的改变可能与氯胺酮诱导大鼠胎鼠海马神经元凋亡的机制有关。