肺脏是至关重要的生理器官,由多种介导呼吸作用和气体交换的细胞组成。肺组织中包含多种免疫细胞类型,例如肺泡和间质巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞和淋巴细胞(包括循环和组织驻留记忆T细胞)。肺脏不断暴露于致病性和非致病性的微生物和环境中,表明动力学机制对于维持组织完整性至关重要。甲型流感病毒(Influenza virus,IAV)是一种十分常见的呼吸道病毒,每年的季节性流感均会对公共卫生造成压力和经济负担。部分流感病毒株也会形成区域性流行,对人们健康和社会稳定造成严重影响。流感病毒的主要靶细胞为呼吸道的上皮细胞,并通过细胞表面唾液酸受体进入靶细胞。宿主对感染的反应源于许多单个细胞(感染和未感染)的综合反应。要了解在组织和生物体水平上控制宿主反应的因素,至关重要的是定义单细胞感染反应的变异模式。单细胞测序技术是指能够在单个细胞的水平上,对基因组或转录组进行高通量测序,利用其对多个生物学问题进行揭示的技术。与传统高通量测序相比,单细胞测序不仅能够分析相同表型细胞的异质性,还能发现新的细胞类型,揭示细胞的发育轨迹,具有广阔的应用前景。对单个细胞中的转录组进行更精确的了解,对于阐明其在细胞功能中的作用以及了解基因表达如何促进有益或有害状态至关重要。为了揭示重症肺炎的免疫微环境的动力学变化,本研究对一例重症肺炎患者发病后的第8天(Day08)、第9天(Day09)、第11天(Day11)三天的肺泡灌洗液(BALF)进行单细胞转录组测序,在肺泡灌洗液中共发现5种类型细胞,分别为T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞(DC)和Ⅰ型肺泡上皮细胞(AT1)。在T细胞的单细胞转录组测序中,我们发现在BALF中的T细胞比例在连续的不同时间点中明显减少,并且随着时间点的变化,细胞所处周期对细胞分群具有一定影响,T细胞中G1期的CD8+细胞毒性T细胞的比例明显增多,细胞毒性相关基因和趋化因子表达水平均高出处于S期或G2M期的毒性T细胞。Treg细胞比例不与病程相关,PDCD1在病程后期表达明显增高。在T细胞中发现了混入的少量NK细胞,发现在单细胞测序中出现T细胞与NK细胞的无法有效进行区分。在T细胞中与病程变化相同的基因表达的规律性变化值得去深入分析如CD48、CCR7、ANXA2等,在NK细胞中我们发现DAY11时趋化因子配体的表达异常增高,如CCL2、CCL3、CXCL8 等。在B细胞中,发现捕获的B细胞大多数为CD19loCD38hiCD27hi即浆细胞,多数B细胞都表达免疫球蛋白相关基因IGHG1、IGHG3等。在B细胞亚群2(BSC2)中,我们发现了既表达B细胞标记基因又表达T细胞标记基因的细胞亚群,由于B和T细胞间并不存在相互转化,所以该亚群很有可能为“双细胞”亚群,并且为异种双细胞亚群。在CD14+单核巨噬细胞(CD14+M/M)中,细胞比例随着时间点逐渐增加,表明巨噬细胞在流感感染后肺部免疫中的重要性。可以将CD14+M/M细胞根据自动聚类分为七个亚群,并且通过GO分析查找每个亚群的功能富集,并根据功能进行分析。在使用NF-κB途径对单核细胞炎症情况的动态分析进行表征时,发现信号通路上的基因表达多数都在降低,可以说明炎症情况的改善,也说明患者病情在逐渐缓解,虽然此时已然没有临床指征的变化。其中的部分高变显著基因如IKBKB,MYD88,IRAK1,RIPK1,TNF,TRADD的规律性变化有望作为临床炎症指标变化的标记基因。为了进一步分析肺部上皮细胞在流感病毒感染后的免疫动力学变化,对PR8流感病毒感染小鼠肺部的不同时间点的肺组织进行单细胞转录组测序,发现我们捕获的细胞类型较少,只有AT1、AT2、AT1/AT2、纤毛细胞。其中AT2可以进一步分型为普通的AT2和Pcolce2hiAT2。在上皮细胞比例不断变化的过程中,后期AT1的增多表明受到损伤的肺脏的进一步重建。上皮细胞在早期并没有显著性的炎症相关因子的高表达,说明在极早期并不会由于非免疫细胞的激活而导致炎症。对ISGs在上皮细胞的不同时间点的表达情况进行分析发现(1)ISG的表达时间的变化规律根据其功能来确定;(2)多数ISGs包括RNA进程(RNA processing),代谢调控(metabolic regulation),炎症介导或调控(inflammation mediators or regulators)随时间点的变化并不明显,也许是由于其并不是由于病毒感染所导致的直接效应分子;(3)抗病毒家族(predominantly of antiviral family)成员中的ISGs在不同细胞类型中的转录水平变化较为一致,如Irf7、Gbp2、Isg15、Ly6e、Lgals3bp,在Day4天转录水平就已经达到高峰,部分在Day13转录水平下降,说明在Day4细胞的天然免疫已经被全面激活,无论是直接通过病毒进行感染还是通过细胞间的旁观者效应(crosstalk)。本文通过人体重症肺炎患者和小鼠PR8流感病毒感染模型,利用单细胞转录组技术对流感感染肺部炎症反应的动力学变化进行分析揭示,为肺部免疫的动力学变化提供参考依据,为针对特定变化基因进行免疫治疗提供新靶点。