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肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率占世界第三，而且在引起死亡的恶性肿瘤中它也是名列前茅，它具有恶性程度高，容易转移和复发等特点，是严重影响人类健康的疾病。其中，其高转移率和复发率是造成其高死亡率的重要原因[1]。近年来越来越多的研究表明，microRNA表达异常与多种实体瘤发生发展密切相关，它可以通过影响多条信号通路来对肿瘤细胞的恶性生物学行为进行调整，而它对肝癌的发生发展以及肝癌细胞转移和增殖等恶性生物学行为的影响尚未明了。MicroRNA是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录生成的微小核糖核甘酸，通常由19-25个碱基组成，在机体的生长发育、代谢过程中起到重要作用。研究发现，它主要是通过与靶mRNA的3’-UTR区完全或部分结合使靶基因降解或沉默，进而影响肿瘤的发生发展，发挥了类似癌基因或抑癌基因的作用,同一个miRNA可能同时调控几个不同的mRNA，同一个mRNA也可以受到几个不同的miRNA的调节，类似于基因密码子的匹配机制，参与了细胞总蛋白表达的30%左右，形成了一个很大的网络。我们通过生物学信息预测和荧光素酶报告基因实验发现CYLD可能是miRNA-362-5p发挥作用的一个潜在靶点。CYLD则是2003年在Nature杂志报道的肿瘤抑制基因，它作为一个去泛素化酶可以抑制NF-κB、JNK、Wnt/β-catenin等信号通路激活，在细胞周期的调控、细胞增殖、抑制肿瘤发生等分子事件中起着重要的调控作用[2]，研究发现，它与多种实体瘤的发生有着密切关系，如宫颈癌、结肠癌、肾癌等[3,4]。而在肝癌中miRNA-362-5p是否通过靶作用于CYLD而影响肝癌细胞的生物学行为尚未有明确报道。为了探讨miRNA-362-5p异常表达在肝癌发生发展中的作用，我们用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从肝癌组织和细胞系中扩增基因mirRNA-362-5p，用瞬时转染的方法向肝癌细胞HepG2和正常肝脏细胞HL-02中转入Anti-mirR-362-5p及其激动剂，RT-PCR检测转染效率，Western-blot检测NF-kB信号路径的激活情况，探讨肝癌细胞恶性生物学行为的改变，实验结果如下：首先，成功的提取了肝癌组织和癌旁组织总RNA，利用聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增了组织中的miRNA-362-5p，灰度分析发现肝癌组织中miRNA-362-5p表达是癌旁组织的2-3倍，细胞培养提取的RNA RT-PCR结果与该情况一致。之后寻找miRNA-362-5p的作用靶点，通过生物学信息预测和荧光素酶报告基因实验，发现CYLD可能是miRNA-362-5p发挥作用的一个潜在功能靶点，为了证明这一发现，我们以miRNA-362-5p的抑制剂（Anti-miRNA-362-5p）和激动剂（miRNA-362-5p-mimics）荧光转染293A（人胚胎肾细胞）细胞(因为荧光素酶试验选用的是293A细胞，该实验是预实验的一部分)，培养48h，提取细胞总蛋白，Western-blot实验发现CYLD水平直接受到miRNA-362-5p抑制剂和激动剂影响，初步证实了CYLD是miRNA-362-5p发挥作用的靶点。进一步实验确定在肝脏细胞系中CYLD是miRNA-362-5p发挥作用的一个靶点，试验中又将miRNA-362-5p的抑制剂和激动剂分别转染了miRNA-362-5p高表达的HepG2和低表达的HL-02细胞，发现在这两种肝脏细胞系的CYLD表达也受到miRNA-362-5p调节：在HepG2细胞中转染抑制剂后CYLD表达上调；在HL-7702细胞转染激动剂后CYLD表达下调，并且细胞的增殖能力增强。之后，我们检测了Anti-miRNA-362-5p转染HepG2细胞的恶性生物学行为改变，首先是检测了细胞的迁移能力，抑制剂转染HepG2细胞后细胞的迁移能力明显减弱，为了验证这个过程是通过CYLD发挥作用的，我们以siRNA干扰了HepG2细胞中CYLD的表达，抑制剂共转染HepG2细胞，逆转了抑制剂对细胞迁移的作用，细胞迁移速度增快。之后为了排除细胞增殖对迁移的影响，做了MTT细胞增殖实验，虽然未排除增殖的影响，但是发现抑制剂转染后HepG2细胞，其增殖明显弱于对照组，为了探讨细胞迁移能力和侵袭能力的变化，我们做了Tran-swells小室迁移和侵袭实验，抑制剂转染后HepG2细胞后迁移和侵袭能力都减弱了；为了进一步探讨细胞体外克隆形成能力的变化，我们做了二维平板克隆形成实验和三维软琼脂集落形成实验，细胞转染抑制剂后克隆形成能力明显减弱。为了进一步探讨肝癌细胞恶性生物学行为发生改变的分子机制，我们提取了转染miRNA-362-5p抑制剂的HepG2细胞和激动剂的HL-02细胞胞浆蛋白及胞核蛋白，Western-Blot实验发现NF-кB信号途径激活减弱，而该途径是已知的与细胞增殖、凋亡等恶性生物学行为密切相关的一条重要信号通路，也就表明高表达的miRNA-362-5p通过沉默或下调NF-кB的负性调节因子CYLD而增强细胞的增殖、迁移等能力。