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口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病，主要感染牛、猪、羊及野生动物等70多种偶蹄物种，世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为法定通报传染病。在口蹄疫防控中，猪口蹄疫有其特殊性:主要通过直接接触发病动物、病毒污染物等传播，对气源性感染不敏感;临床症状明显，少见亚临床感染:发病猪可以通过呼吸道排出大量病毒:感染毒株有宿主嗜性:产生有效免疫应答需免疫高剂量的抗原:疫苗免疫不能阻断病毒在猪体内的传播，仅可以延缓疫病暴发。世界各国主要对牛口蹄疫展开研究，对猪口蹄疫的研究甚少，这造成中国在猪口蹄疫防控工作中无经验可参考。面对近年来中国严峻的猪口蹄疫疫情，展开对猪口蹄疫各项研究具有必要性和紧迫性。本文构建了猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株感染性克隆，在VP1G-H环RGD上游(-4)和下游(+10)住插入外源标记，通过分子生物学、免疫学和生物信息学方法对猪口蹄疫病毒进行了研究，旨在探索重组病毒的致病性、变异性以及免疫原性的变化趋势，寻找能区分口蹄疫感染抗体和免疫抗体的分子标记疫苗候选株，为有效防控该病提供技术支撑。
1.外源基因FLAG可以插入在猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株VPIG-H环RGD上游(-4)和下游(+10)位
口蹄疫病毒G-H环突出于衣壳表面，位于结构蛋白VP1140-160位，是口蹄疫病毒结构蛋白中最易变的区域，具有一定柔韧性。猪源O/CHA/90株是一株分自中国边境地区发病猪的流行毒株，属于O型口蹄疫Cathay拓扑型，是中国大陆用于制备猪用口蹄疫灭活疫苗的制苗毒株。本研究成功构建了猪源口蹄疫O/CHA/90株全长感染性克隆，并在结构蛋白VP1G-H环的RGD上游(-4)141/142位点、RGD下游(+10)157/158(R/A)位分别插入8个氨基酸(DYKDDDDK)的FLAG标记表位。成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHM90和vO/CHA/90-FLAG。标记病毒能在BHK-21细胞上能稳定传代、产生CPE，而且病毒毒力、蚀斑形态、复制能力与亲本病毒vO/CHA/90相似。标记病毒对乳鼠致病，在乳鼠上稳定传代，且毒力与亲本病毒相似。外源FLAG标记在传代细胞毒和乳鼠毒能稳定存在。结果表明了G-H环的灵活性，RGD(-4)和RGD(+10)位允许8个氨基酸外源FLAG基因的插入，且FLAG标记能稳定存在于传代标记病毒中。
2.外源基因FLAG的插入不影响病毒RGD基序通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞
口蹄疫病毒感染细胞主要依赖于宿主细胞表面的受体，它主要通过三种不同的途径进入细胞完成组装和释放等，包括需要RGD基序的整合素受体途径、不需要RGD基序的硫酸乙酰肝素HS受体途径和不确定的未知途径。用两株标记病毒分别感染BHK-21细胞和CHO系列细胞(CHO-K1、CHO-618、CHO-745和CHO-677细胞).结果显示标记毒株和亲本毒株都只能在BHK-21细胞上形成蚀斑，而不能在CHO系列细胞上生长;依据插入FLAG位点G-H环上142-157位氨基酸肽段，设计了三段人工合成肽，分别进行肽封闭试验，结果显示两条含RGD的肽可不同程度的抑制病毒侵入BHK-21细胞，而含KGE的对照肽段不能抑制病毒侵入BHK-21细胞，表明标记病毒仍然是通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞的。
3.FLAG袁位的插入对病毒反应原性和中和反应的影响
为了研究FLAG的插入对病毒抗原反应性的影响，采用抗FLAG单克隆抗体和兔抗口蹄疫病毒抗体进行双荧光共聚焦检测，标记病毒感染细胞均与相应的FMDV抗体、FLAG抗体发生反应。结果表明标记病毒能与FMDV抗体及FLAG抗体发生良好反应。为了检测标记病毒中和口蹄疫抗体和FLAG抗体的能力，用亲本毒株O/CHA/90毒株制备的口蹄疫高免血清能完全中和标记病毒。48-72h中和效价(Log10)分别为vFLAG-O/CHA/903.08士0.66、vO/CHA/90-FLAG2.34士0.66、vO/CHA/901.77+0.66；但鼠源抗FLAG单克隆抗体仅能明显延缓病毒致BHK-21细胞出现CPE时间，48h后-FLAG单抗处理的标记毒株才出现CPE，48h中和效价(Log10)分别为:vFLAG-O/CHA/902.61士0.05、vO/CHA/90-FLAG2.07士0.04。这可能是鼠源抗FLAG单克隆抗体延缓了病毒的侵入或者延缓病毒进入细胞的复制和致病变特性改变。
4.FLAG的插入位置对病毒抗原位点和FLAG位点展示的影响
将病毒传代后，经结构蛋白P1区编码核苷酸序列测定比较发现，RGD序列及FLAG序列稳定不变，VP183住氨基酸均由E变K，该变异常见于适应于BHK-21细胞的口蹄疫病毒。FLAG标记病毒中，vFLAG-O/CHA/90在VP1和VP3上出现三个氨基酸的特有变化，VP3第54位氨基酸由F变L，VP1第142位氨基酸由N变S、第188位氨基酸由D变G。而vO/CHA/90-FLAG仅VP3第86位氨基酸由M变L。三维立体结构预测显示了FLAG、G-H loop环和RGD基序的空间构象差异，其中vFLAG-O/CHA/90的FLAG8个氨基酸的空间折叠序列在141-148位充分朝外伸展。得到了充分展示，而vO/CHA/90-FLAG的FLAG序列在158-165位向内弯成小圈。将病毒制备灭活疫苗，免疫9-10周龄、约20g的Balb/c小鼠各4只。0天、14天各免疫一次(5μg/只)，28天后采血测口蹄疫和FLAG抗体。结果显示:灭活病毒抗原均产生高水平的口蹄疫抗体，但只有vFLAG-O/CHA/90病毒抗原免疫小鼠产生抗FLAG抗体。可见突变位点虽然不直接与G-H环或FLAG袁位发生作用，但通过变异影响了病毒结构的变化和抗原位点的改变，可能影响标记抗原袁位的展示和嵌合病毒在体内诱导抗体产生。
5.标记毒株对猪的致病力以及免疫应答水平评估
用体重为40kg左右的健康易感猪共9头，标记毒株及亲本毒株各3头分别颈部肌肉注射鼠毒液2×105LD50。标记病毒攻毒经肌肉注射后无任何临床症状:亲本毒株O/CHA/90攻毒经肌肉注射后猪发病显著，鼻镜、蹄叉、蹄冠、蹄掌等部位均有不同程度的水泡或破损。猪注射标记毒株后FMDV抗体一直保持低水平，猪注射亲本毒株后FMDV抗体于3天后开始上升，5-6天到达顶峰(L0g10=3.15)，之后保持高水平抗体。这说明标记病毒没有很好启发机体的免疫应答，而亲本毒株在猪体内有增殖反应，能有效启动机体的体液免疫应答。将病毒配制灭活疫苗，0天、21天备免疫一次(10μg/头)，之后28天用O/CHA/90毒株1000ID50攻毒，连续观察10天。21天采血测FMDV和FLAG抗体。结果表明。标记疫苗在加强免疫或攻毒后10天均产生较高水平的抗FMDV抗体，但仅标记疫苗vFLAG-O/CHA/90产生了不同程度的FLAG抗体，这印证了小鼠免疫实验结果。vFLAG-O/CHA/90对猪不致病，免疫后能产生高水平的FMDV抗体和FLAG抗体，且能通过检测手段区分感染动物和免疫动物，是一株有潜力的标记疫苗候选毒株。
综上所述，本研究在古典中国拓扑型O型口蹄疫病毒G-H环的RGD上游(-4)和下游(+10)位分别插入FLAG标记，并成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHA/90和vO/CmV90-FLAG:FLAG插入能稳定存在于标记病毒细胞和乳鼠传代病毒中、未改变病毒整联蛋白受体感染细胞的特性:标记病毒能与口蹄疫抗体和FLAG抗体反应:标记毒株对猪无致病力，仅vFLAG-O/CHA/90灭活抗原可以诱导小鼠和猪产生抗FLAG袁位抗体，该病毒结构蛋白上三个氨基酸发生变异可能有助于FLAG表位的展示和诱导抗体的表达。FLAG标记病毒的拯救为研究者通过FLAG抗原标签的追踪来进一步研究猪源口蹄疫的致病机制和免疫机理提供了一种方法，为开展猪口蹄疫的研究提供了一种思路，同时也为未来FLAG标记疫苗的制备提供了一种可能，将有望解决生产检验中区别自然感染与免疫动物的难题。
1.外源基因FLAG可以插入在猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株VPIG-H环RGD上游(-4)和下游(+10)位
口蹄疫病毒G-H环突出于衣壳表面，位于结构蛋白VP1140-160位，是口蹄疫病毒结构蛋白中最易变的区域，具有一定柔韧性。猪源O/CHA/90株是一株分自中国边境地区发病猪的流行毒株，属于O型口蹄疫Cathay拓扑型，是中国大陆用于制备猪用口蹄疫灭活疫苗的制苗毒株。本研究成功构建了猪源口蹄疫O/CHA/90株全长感染性克隆，并在结构蛋白VP1G-H环的RGD上游(-4)141/142位点、RGD下游(+10)157/158(R/A)位分别插入8个氨基酸(DYKDDDDK)的FLAG标记表位。成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHM90和vO/CHA/90-FLAG。标记病毒能在BHK-21细胞上能稳定传代、产生CPE，而且病毒毒力、蚀斑形态、复制能力与亲本病毒vO/CHA/90相似。标记病毒对乳鼠致病，在乳鼠上稳定传代，且毒力与亲本病毒相似。外源FLAG标记在传代细胞毒和乳鼠毒能稳定存在。结果表明了G-H环的灵活性，RGD(-4)和RGD(+10)位允许8个氨基酸外源FLAG基因的插入，且FLAG标记能稳定存在于传代标记病毒中。
2.外源基因FLAG的插入不影响病毒RGD基序通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞
口蹄疫病毒感染细胞主要依赖于宿主细胞表面的受体，它主要通过三种不同的途径进入细胞完成组装和释放等，包括需要RGD基序的整合素受体途径、不需要RGD基序的硫酸乙酰肝素HS受体途径和不确定的未知途径。用两株标记病毒分别感染BHK-21细胞和CHO系列细胞(CHO-K1、CHO-618、CHO-745和CHO-677细胞).结果显示标记毒株和亲本毒株都只能在BHK-21细胞上形成蚀斑，而不能在CHO系列细胞上生长;依据插入FLAG位点G-H环上142-157位氨基酸肽段，设计了三段人工合成肽，分别进行肽封闭试验，结果显示两条含RGD的肽可不同程度的抑制病毒侵入BHK-21细胞，而含KGE的对照肽段不能抑制病毒侵入BHK-21细胞，表明标记病毒仍然是通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞的。
3.FLAG袁位的插入对病毒反应原性和中和反应的影响
为了研究FLAG的插入对病毒抗原反应性的影响，采用抗FLAG单克隆抗体和兔抗口蹄疫病毒抗体进行双荧光共聚焦检测，标记病毒感染细胞均与相应的FMDV抗体、FLAG抗体发生反应。结果表明标记病毒能与FMDV抗体及FLAG抗体发生良好反应。为了检测标记病毒中和口蹄疫抗体和FLAG抗体的能力，用亲本毒株O/CHA/90毒株制备的口蹄疫高免血清能完全中和标记病毒。48-72h中和效价(Log10)分别为vFLAG-O/CHA/903.08士0.66、vO/CHA/90-FLAG2.34士0.66、vO/CHA/901.77+0.66；但鼠源抗FLAG单克隆抗体仅能明显延缓病毒致BHK-21细胞出现CPE时间，48h后-FLAG单抗处理的标记毒株才出现CPE，48h中和效价(Log10)分别为:vFLAG-O/CHA/902.61士0.05、vO/CHA/90-FLAG2.07士0.04。这可能是鼠源抗FLAG单克隆抗体延缓了病毒的侵入或者延缓病毒进入细胞的复制和致病变特性改变。
4.FLAG的插入位置对病毒抗原位点和FLAG位点展示的影响
将病毒传代后，经结构蛋白P1区编码核苷酸序列测定比较发现，RGD序列及FLAG序列稳定不变，VP183住氨基酸均由E变K，该变异常见于适应于BHK-21细胞的口蹄疫病毒。FLAG标记病毒中，vFLAG-O/CHA/90在VP1和VP3上出现三个氨基酸的特有变化，VP3第54位氨基酸由F变L，VP1第142位氨基酸由N变S、第188位氨基酸由D变G。而vO/CHA/90-FLAG仅VP3第86位氨基酸由M变L。三维立体结构预测显示了FLAG、G-H loop环和RGD基序的空间构象差异，其中vFLAG-O/CHA/90的FLAG8个氨基酸的空间折叠序列在141-148位充分朝外伸展。得到了充分展示，而vO/CHA/90-FLAG的FLAG序列在158-165位向内弯成小圈。将病毒制备灭活疫苗，免疫9-10周龄、约20g的Balb/c小鼠各4只。0天、14天各免疫一次(5μg/只)，28天后采血测口蹄疫和FLAG抗体。结果显示:灭活病毒抗原均产生高水平的口蹄疫抗体，但只有vFLAG-O/CHA/90病毒抗原免疫小鼠产生抗FLAG抗体。可见突变位点虽然不直接与G-H环或FLAG袁位发生作用，但通过变异影响了病毒结构的变化和抗原位点的改变，可能影响标记抗原袁位的展示和嵌合病毒在体内诱导抗体产生。
5.标记毒株对猪的致病力以及免疫应答水平评估
用体重为40kg左右的健康易感猪共9头，标记毒株及亲本毒株各3头分别颈部肌肉注射鼠毒液2×105LD50。标记病毒攻毒经肌肉注射后无任何临床症状:亲本毒株O/CHA/90攻毒经肌肉注射后猪发病显著，鼻镜、蹄叉、蹄冠、蹄掌等部位均有不同程度的水泡或破损。猪注射标记毒株后FMDV抗体一直保持低水平，猪注射亲本毒株后FMDV抗体于3天后开始上升，5-6天到达顶峰(L0g10=3.15)，之后保持高水平抗体。这说明标记病毒没有很好启发机体的免疫应答，而亲本毒株在猪体内有增殖反应，能有效启动机体的体液免疫应答。将病毒配制灭活疫苗，0天、21天备免疫一次(10μg/头)，之后28天用O/CHA/90毒株1000ID50攻毒，连续观察10天。21天采血测FMDV和FLAG抗体。结果表明。标记疫苗在加强免疫或攻毒后10天均产生较高水平的抗FMDV抗体，但仅标记疫苗vFLAG-O/CHA/90产生了不同程度的FLAG抗体，这印证了小鼠免疫实验结果。vFLAG-O/CHA/90对猪不致病，免疫后能产生高水平的FMDV抗体和FLAG抗体，且能通过检测手段区分感染动物和免疫动物，是一株有潜力的标记疫苗候选毒株。
综上所述，本研究在古典中国拓扑型O型口蹄疫病毒G-H环的RGD上游(-4)和下游(+10)位分别插入FLAG标记，并成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHA/90和vO/CmV90-FLAG:FLAG插入能稳定存在于标记病毒细胞和乳鼠传代病毒中、未改变病毒整联蛋白受体感染细胞的特性:标记病毒能与口蹄疫抗体和FLAG抗体反应:标记毒株对猪无致病力，仅vFLAG-O/CHA/90灭活抗原可以诱导小鼠和猪产生抗FLAG袁位抗体，该病毒结构蛋白上三个氨基酸发生变异可能有助于FLAG表位的展示和诱导抗体的表达。FLAG标记病毒的拯救为研究者通过FLAG抗原标签的追踪来进一步研究猪源口蹄疫的致病机制和免疫机理提供了一种方法，为开展猪口蹄疫的研究提供了一种思路，同时也为未来FLAG标记疫苗的制备提供了一种可能，将有望解决生产检验中区别自然感染与免疫动物的难题。