目前,在我国奶牛早期妊娠诊断技术不断发展的同时,国外早期妊娠诊断产品也不断出现。随着奶牛养殖规模化程度的提高,简单有效、经济的妊娠诊断方法对适应产业发展形势越来越重要。奶牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)是目前所知最早确认妊娠的生物化学标志物之一,它的有无可作为早期妊娠诊断的重要指标。妊娠所产生的EPF来源不同,可能与子宫、卵巢、输卵管、受精卵、胎盘、垂体等有关。采用实时荧光定量PCR技术,从基因水平检测生物体基因拷贝数,定量分析奶牛子宫、胎盘、卵巢、输卵管、外阴皮肤和阴道黏液组织中的EPF基因的表达量,对准确诊断奶牛早期妊娠状况具有重要意义。胶体金技术具有易制备、成本低、结果直观可靠等优点。利用奶牛早孕因子结合胶体金技术制备免疫层析胶体金快速诊断试纸条,对现场快速诊断奶牛妊娠状况有重要意义。本研究首先利用实时荧光定量PCR方法检测4~6岁孕牛和未孕牛子宫、胎盘、卵巢、输卵管、外阴皮肤和阴道黏液组织中的EPF基因的表达量差异,研究实时荧光定量PCR方法检测EPF表达量作为奶牛早期妊娠的可行性。同时,采用双抗体夹心ELISA方法筛选出配对单克隆抗体,探讨了免疫层析胶体金快速检测奶牛早期妊娠试纸条方法。具体研究结果如下:1、实时荧光定量PCR发现子宫和外阴部皮肤中EPF表达量与阴性对照组相比差异不显著;卵巢和胎盘中的EPF表达量与阴性对照组相比差异显著(P<0.05);输卵管和阴道黏液中EPF表达量与阴性对照组相比差异极显著(P<0.01)。孕牛EPF存在于子宫、卵巢、胎盘、输卵管、阴道黏液和外阴皮肤中。阴道黏液的采集相对方便,且不伤害家畜,通过实时荧光定量PCR检测EPF基因表达量可以作为诊断奶牛早期妊娠的一种有效方法。2、双抗体夹心ELISA方法成功筛选出配对单抗六对,检测人工重组牛EPF蛋白的线性检测范围可达234~937ng/mL,检测灵敏度约为60ng/mL,但未检测出孕牛血清中的EPF。3、利用配对单抗制备的胶体金免疫层析试纸条(GICA)检测人工重组牛EPF蛋白的最低检出率是1.5μg/mL,但临床上未检测出孕牛血清和阴道黏液中的EPF。