目的激素性股骨头坏死（Steroid-induced Avascular Necrosis of the Femoral Head,SANFH）是一种长期服用糖皮质激素而引起的严重代谢性骨科疾病,股骨头内血液供应受损,导致骨细胞及骨髓成分的坏死,从而改变股骨头结构,诱发塌陷形成和关节功能障碍,股骨头坏死已成为成年人主要的致残疾病之一,严重影响患者后期的生活质量。DNA甲基化是最广泛研究的表观遗传机制,调节细胞中多种生命活动,包括细胞分化、转录、染色质结构等,课题组前期通过全基因组甲基化测序方法找到磷酸肌醇3-激酶调节亚基5（PIK3R5）基因启动子在SANFH中存在高甲基化状态,可能在SANFH中有着重要的调控作用,本研究着眼于PIK3R5基因在SANFH中甲基化水平的验证和其调控机制的探究。方法1、收集确诊为激素性股骨头坏死和股骨颈骨折病人的股骨头样本,共28例,根据病人病例分别筛选出满足条件的3例实验组和3例正常对照组。采用全基因组甲基化测序结合UMI绝对定量转录组测序技术对6例股骨头样本测序,甲基化差异基因筛选条件为甲基化水平差异倍数log2FC的绝对值大于0.3,P＜0.05,且位于基因的promoter区域。UMI转录组测序结果筛选条件为m RNA表达差异倍数log2FC的绝对值大于1,且P＜0.05。重新收集样本,实验组和对照组各4例,利用甲基化特异性PCR对候选基因PIK3R5的甲基化水平进行验证。m RNA表达层面上,则应用实时荧光定量PCR（q PCR）检测股骨头组织中PIK3R5和PI3K的表达。然后提取股骨头组织的蛋白质,应用Western Blot定性分析并检测PIK3R5及下游基因PI3K的蛋白质表达水平。2、第二部分采用新西兰大白兔进行验证实验,准备好20只健康状况良好的大白兔,随机分为两组,实验组和对照组各10只,实验组用内毒素联合甲泼尼龙构建激素性股骨头坏死模型,对照组则用生理盐水进行对照实验。模型构建完成后使用核磁共振成像技术对实验组和对照组分别进行检查,从实验组结果中筛选出较为明显的3只兔子,对照组也选3只,用于后续实验。苏木素-伊红染色可以直观观察两组在组织形态上的差异情况,同时,应用q PCR和Western Blot实验分别从m RNA表达水平及蛋白质表达水平上对PIK3R5和PI3K进行验证。结果1、人股骨头组织全基因甲基化测序结果显示,PIK3R5基因在激素性股骨头坏死的组织中甲基化水平高于正常股骨头组织（log2FC=0.38,P＜0.05）,且UMI绝对定量转录组结果提示激素性股骨头坏死的PIK3R5的m RNA表达水平明显低于正常对照组（log2FC=-1.28,P＜0.05）。甲基化特异性PCR验证结果显示,8例股骨头组织中PIK3R5基因启动子均存在不完全性甲基化修饰,激素性股骨头坏死患者的甲基化水平要显著高于正常对照组（P＜0.01）。q PCR结果显示激素性股骨头坏死组PIK3R5和PI3K的m RNA表达水平均低于正常对照组（P＜0.05）,Western Blot实验结果与q PCR结果一致,在蛋白表达水平上,激素性股骨头坏死组织中PIK3R5和PI3K均低于正常对照组。2、核磁共振成像结果显示我们成功构建激素性股骨头坏死的兔模型,实验组的T1WI呈现低信号改变,有异常斑点状阴影出现,而T2WI中股骨头部位有较高信号出现,同时伴有少量关节积液。组织病理学上,HE染色结果显示正常对照组和实验组中骨小梁均有不同程度的变纤细,股骨头坏死实验组表现得更加明显,而且存在中断的情况,骨质紊乱,不清晰,部分范围出现骨小梁断裂,发生骨坏死,髓腔内脂肪细胞数量增多,体积变大,并且融合成泡状。在兔激素性股骨头坏死的模型中,q PCR结果和Western Blot结果与人组织结果一致,兔激素性股骨头坏死组织中PIK3R5和PI3K的m RNA表达和蛋白质表达水平均低于正常对照组（P＜0.05）。结论1、PIK3R5基因在激素性股骨头坏死中存在甲基化修饰,且水平增高,与激素性股骨头坏死有密切联系。2、在激素性股骨头坏死中,PIK3R5的表达水平降低,PI3K的表达也降低,而PIK3R5是PI3Kγ复合体的一种调节亚基,因此,我们推测PIK3R5基因启动子的甲基化通过抑制PI3K-AKT信号通路促进激素性股骨头坏死的发生和发展。