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缺血性心脏病是人类死亡的主要病因之一。急性严重的心肌缺血导致心肌细胞坏死,坏死的心肌细胞不可再生,而被纤维组织所代替,出现心肌重塑、心功能下降,逐步恶化的心功能促使恶性心律失常、心脏骤停等严重心脏事件发生,最终导致死亡。因此,人们一直在找寻一方法挽救坏死或濒临坏死的心肌。尽管急诊再灌注治疗能够降低急性心梗患者的早期死亡率并改善预后,但仍无法逆转心梗后心肌重塑而致的心功能不全。通过细胞移植技术将供体干细胞植入受损的心肌组织中,生长并重建心肌以代替纤维组织,同时诱导血管新生,改善心脏功能,为治疗急性心肌梗死提供了一种全新的策略[1]。
骨髓间充质干细胞(marrow stem cells,MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞类型,具有自我更新和多向分化潜能,已证实这类细胞在合适的体内外特定条件下可向成骨、软骨、神经、肌肉、皮肤和肝等多种类型的成熟细胞分化[2~11]。它取材方便、容易分化、易于外源基因的转染和表达[12-14],无免疫原性,无伦理问题。越来越多的证据支持成人干细胞具有多向分化能力而适于心肌、血管的再生治疗[15],MSC是目前应用于细胞移植治疗的较理想的种子细胞[16,17]。已有研究证明心肌梗死后应用MSC移植治疗能够改善心功能,减缓心肌重塑,促进血管新生,而且MSC在移植区域的存活可使其所携带的基因稳定表达,但由于在梗死心肌局部的氧气或营养物质供需失调,MSC的生存能力不足,制约了MSC在心肌梗死部位的存活和分化。
缺氧诱导因子-1(hypoxia induced factor-1,hif-1)是一种参与机体缺氧调节的重要细胞因子,它通过调节代谢、改善供给等提高细胞和组织的耐缺氧能力。Hif-1由hif-1a和hif-1β两个亚基组成,其中hif-1a是它的活性部分。已有研究证明hif-1a能够改善缺氧心肌的功能,但未能证明转染hif-1a的缺血心肌组织能够稳定表达hif-1a,因此hif-1a的作用可能转瞬即逝。
Hif-1a对细胞低氧时凋亡具有双向调节的特点。我们假设hif-1a能够减少MSC低氧时的凋亡,改善MSC缺氧时的生存力和细胞功能,而以MSC作为载体hif-1a在缺氧环境可持续高表达,那末转染hif-1a的MSC则能够显著减缓心梗后心肌重塑、缩小心肌坏死面积。本研究拟观察hif-1a对MSC在低氧时生存和功能的影响,以此作为基础在体实验中对比分析hif-1a对MSC移植治疗心梗效果的影响和机制。本研究的创新在于将联合应用hif-1a和MSC治疗大鼠急性心肌梗死作为研究目标,而目前与此相关的研究目前还很少,我们希望本研究能为急性心梗的治疗的探索做出贡献。
目的:
通过对比应用不同方法、不同血清浓度的培养基在大鼠骨髓间充质干细胞分离培养中的效果,筛选大鼠骨髓间充质干细胞的最佳分离培养方法和培养基的血清浓度。观察低氧时hif-1a转染与未转染的MSC增殖分化的差异,探讨Hif-1a对MSC在低氧环境中的影响。比较不同情况下(hif-1a转染的MSC移植后、空质粒转染的MSC移植后、MSC移植后、未行细胞移植)急性心梗大鼠梗死心肌面积、缺血区毛细血管的新生及心肌重塑的变化,探讨hif-1a对MSC移植治疗大鼠急性心梗效果的影响,并浅析其机制。
材料与方法:
Wistar大鼠处死后分别应用直接贴壁法、密度梯度离心法分离大鼠MSC,常规换液及少量换液方法行细胞培养,并比较在10%、11%、15%不同血清浓度时大鼠MSC的生长状态、细胞数量和群体倍增时间。P3代细胞行细胞表面抗原和细胞分化功能鉴定。应用脂质体作为载体将HIF-1a转染至P3代MSC,荧光观察GFP表达,评估转染效率。应用G418对转染细胞行稳定筛选,应用有限稀释法对筛选后细胞行单克隆培养。将稳定转染的MSC、空质粒转染的MSC和未转染的MSC置于低氧环境下,比较三种细胞生长状态等方面的差异,并检测HIF-1amRNA、VEGFmRNA、HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表达。应用结扎冠状动脉前降支方法制作大鼠心肌梗死模型,将大鼠随机分成假手术组、单纯心梗组、心梗+MSC移植组及心梗+HIF-1a转染MSC移植组,每组取8只大鼠用于结果观察,细胞移植组于心梗模型成功即刻在梗死心肌及其周围行细胞移植。术后4周将大鼠处死后分离心脏,称重,测量左室心腔大小,左室心肌厚度,应用HE染色的方法观察心肌结构、梗死心肌局部及周围毛细血管新生,免疫荧光染色观察移植细胞在心肌局部的分布,westernblot方法检测心肌HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表达。
结果:
分别应用直接贴壁法+常规换液、直接贴壁法+少量换液、密度梯度离心法+常规换液、密度梯度离心法+少量换液的方法分离培养大鼠MSC,细胞的平均倍增时间分别为36.0±0.9小时、23.5±1.1小时、49.8±1.2小时、48.0±0.8小时。MSC在分离后3-10天形成集落,呈漩涡状生长。血清浓度筛选试验中发现11%为MSC生长的最适血清浓度。免疫组化方法细胞表面抗原鉴定CD45(-),CD90(+);流式细胞仪分析MSC细胞表面抗原表达CD450.38%,CD9098.4%。P3代MSC可以成功向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。
应用脂质体法可以成功将pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP转染至MSC,转染效率21%。经G418筛选、应用有限稀释法获得稳定转染的MSC单细胞克隆。稳定转染的MSC仍具有向脂肪细胞及软骨细胞分化的能力,且在低氧条件下(CoCl2模拟缺氧)pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP稳定转染的MSC较空质粒(pcDNA3.0-eGFP)转染的MSC和未转染的MSC凋亡率下降(P<0.05),增殖旺盛(P<0.05),并能高表达hif-1a mRNA及蛋白(P<0.05)、VEGF mRNA及蛋白(P<0.05)。
大鼠急性心梗模型手术成功率为37%。HIF-1a转染的MSC移植组移植细胞成活率显著高于其他各组(P<0.05)。术后4周时HIF-1a转染的MSC移植组大鼠的心脏重量、左心室腔大小显著低于其他3组(P<0.05),左室心肌厚度显著高于其他组(P<0.05),梗死心肌及其周围毛细血管增生较其他组显著增加(P<0.05)。HIF-1a转染的MSC移植组大鼠心肌显著高表达HIF-1a蛋白(P<0.05)及VEGF蛋白(P<0.05)。
结论:
应用直接贴壁法和少量换液方法分离培养的MSC增殖快。11%应为MSC生长的较适血清浓度。
Hif-1a稳定转染的MSC在低氧时高表达hif-1a蛋白、hif-1a mRNA、VEGF蛋白和VEGFmRNA。Hif-1a高表达能减少MSC低氧时的凋亡,并使其表现出较强的增殖能力。
Hif-1a能够提高MSC在梗死心肌局部的生存率,Hif-1a高表达的MSC能显著抑制心梗后心肌重塑,增加梗死心肌周围毛细血管密度。其可能机制与低氧时hif-1a高表达,促进VEGF高表达,从而提高了毛细血管新生相关。