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研究背景:结直肠癌是发病率和死亡率最高的癌症之一,由于结直肠癌起病隐匿,发现时多为晚期,目前对于晚期结直肠癌患者缺乏有效的临床治疗手段,从而导致治疗效果差和预后不良。本课题组以往的研究发现脂肪与消化道肿瘤的发生发展有着密切的联系,而结直肠本身又处于一种富脂环境。所以,对于结直肠癌与腹腔脂肪是否存在联系,引起了我们的关注。研究目的:本课题旨在研究脂肪细胞来源的外泌体miRNA调控结直肠癌辐射敏感性的作用,探索其中的调控机制,为提高临床结直肠癌放疗疗效提供实验依据。研究方法:（一）脂肪细胞增加结直肠癌细胞的辐射抗性:1、获取人腹腔脂肪组织,使用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织,分离出游离脂肪细胞;2、建立脂肪细胞与结直肠癌细胞共培养模型,通过免疫荧光、WB实验观察结直肠癌细胞照射后细胞DNA损伤情况;3、通过细胞凋亡实验检测脂肪细胞对受照结直肠癌细胞的凋亡程序的激活;（二）脂肪来源外泌体介导脂肪对肿瘤细胞放射敏感性的调控作用:1、脂肪细胞来源外泌体的分离、提取、表征;2、通过免疫荧光实验检测外泌体是否被癌细胞摄取,以及摄取量随时间的变化情况;3、通过WesternBlot和免疫荧光实验检测对照组和共培养模型电离辐射后结直肠癌细胞DNA损伤情况;4、通过细胞凋亡实验检测脂肪细胞对受照结直肠癌细胞的凋亡程序的激活;5、利用裸鼠移植瘤模型,在体内证实外泌体上述效应;（三）脂肪外泌体来源的microRNA参与调控结直肠癌辐射敏感性:1、通过脂肪外泌体miRNA seq,锚定得出14个miRNAs;2、十组样本RT-PCR验证,寻找目标miRNA（miR-199b-5p）;3、结直肠癌细胞转染稳转株病毒的miR-199b-5p,通过克隆形成实验观察结直肠癌细胞照射后细胞存活能力;4、通过WesternBlot和免疫荧光实验检测miR-199b-5p mimic的结直肠癌细胞电离辐射后DNA损伤情况;5、通过凋亡实验检测脂肪细胞对受照结直肠癌细胞的凋亡程序的激活;（四）预测下游靶基因,解析调控机制:1、利用数据库分析对miR-199b-5p的靶基因进行预测,得出5个靶基因;2、采用RT-PCR初步确定miR-199b-5p对于靶基因mRNA水平的调控能力;3、双荧光素酶报告确定miR-199b-5p对于靶基因直接的调控能力;4、靶基因功能验证。研究结果:（一）脂肪细胞增加结直肠癌细胞的辐射抗性:1、WB和免疫荧光显示与脂肪细胞共培养可减轻电离辐射后结直肠癌细胞的DNA损伤情况;2、细胞凋亡实验表明与脂肪细胞共培养可以降低电离辐射后结直肠癌细胞的凋亡率;（二）脂肪来源外泌体介导脂肪对肿瘤细胞放射敏感性的调控作用:1、首先从脂肪组织中得到游离的脂肪细胞,从脂肪细胞的浸出液中提取分离鉴定了外泌体;2、WB和免疫荧光的结果显示加入外泌体可减轻电离辐射后结直肠癌细胞的DNA损伤情况;3、细胞凋亡实验结果表明加入外泌体后可降低电离辐射后结直肠癌细胞的凋亡率;4、裸鼠移植瘤模型证实外泌体的上述效应,注射了外泌体的裸鼠移植瘤体积更大;（三）脂肪外泌体来源的microRNA参与调控结直肠癌辐射敏感性:1、通过脂肪细胞来源外泌体miRNA seq,锚定得到得到了 14个潜在miRNA,并通过RT-PCR验证了这14个miRNA,寻找得到了目标miRNA（miR-199b-5p）;2、结肠癌细胞转染稳转株病毒的miR-199b-5p,克隆形成实验结果显示电离辐射后结直肠癌细胞克隆形成率增加,细胞存活能力增强;3、WB的结果显示电离辐射后转染了 miR-199b-5p mimics的结肠癌细胞DNA损失情况减轻;4、细胞凋亡实验结果显示电离辐射后转染了 miR-199b-5p mimics的结肠癌细胞有着更低的凋亡率;（四）下游靶基因的预测,调控机制解析:1、通过三个数据库对于miR-199b-5p的靶基因预测结果进行韦恩图分析,取交集得到5个潜在靶基因;2、RT-PCR初步确定miR-199b-5p对于靶基因mRNA水平的调控能力,进一步确定了 3个目标靶基因;3、双荧光素酶报告确定miR-199b-5p对于靶基因直接的调控能力,锁定到了靶基因JAG1;4、功能实验验证其效应。研究结论:（1）脂肪细胞可增强结直肠癌细胞出现辐射抗性;（2）脂肪细胞来源外泌体可以使结直肠癌细胞出现辐射抗性;（3）脂肪细胞来源外泌体中的miR-199b-5p可以影响结直肠癌细胞的辐射敏感性;（4）脂肪细胞来源外泌体中miR-199b-5p的靶基因JAG1调控结直肠癌细胞的辐射敏感性。