Maltocin P28 是 Stenotrophomonas maltophilia P28 产生的一种细菌素,是一种类似噬菌体尾部结构的多蛋白复合体,能够抑制多株嗜麦芽寡养单胞菌的生长。Maltocin P28基因簇预测包含23个ORFs,orf10-orf23编码的蛋白与细菌素结构有关,其中orf17和orf18分别编码尾鞘蛋白和尾管蛋白,orf1-orf9编码的为非结构蛋白。本论文主要研究orf1-orf9中与maltocinP28合成有关的调控基因。首先,通过反转录PCR检测了预测的orf1-orf9的转录本。除了 orf2之外,其它的均检测有mRNA,说明orf2不转录,而其它的预测基因均能转录,并且orf6-9共转录。随后,构建了基因缺失菌株P28△orf1、P28△orf6(N)、P28△orf5-6和P28△orf4-6(N)。检测这些突变菌株培养物上清的杀菌活性发现,与出发菌株P28相比,P28△orf1和P28△orf5-6菌株的杀菌活性没有改变,而P28△orf6(N)和P28△orf4-6菌株则没有杀菌活性。前期本实验室已经构建了o f3、orf4、orf7、orf8和orf9的缺失菌株,并且确定orf3缺失菌株培养物上清没有杀菌活性,orf4、orf7、orf8和orf9缺失的菌株培养物上清杀菌活性都没有改变。用Western blot方法检测了所有缺失突变菌株胞内的尾鞘蛋白,结果P28△orf3和P28△orf6(N)胞内未检测到有尾鞘蛋白,而P28△orf5-6尾鞘蛋白量比P28菌株的高,其它突变菌株的尾鞘蛋白量则与P28菌株的持平。根据以上结果推测orf3和orf6促进尾鞘基因的表达,orf5可能抑制尾鞘基因的表达。为了排除基因敲除的极性效应影响,分别构建了相应的回补质粒pRK415-ORF3、pRK415-ORF5、pRK415-ORF6,回补到对应的基因缺失菌株中。结果ORF6回补P28△orf6(N)菌株的培养物上清没有检测到杀菌活性,但是western blot检测胞内有尾鞘蛋白。这说明orf6促进尾鞘蛋白的表达,并且orf6缺失后可能影响了 maltocinP28的组装或者释放,导致P28△orf6(N)回补菌株培养物上清没有杀菌活性。另外我们发现ORF6在orf3缺失菌株中过表达能够回补orf3缺失菌株的杀菌活性,并且胞内也检测到尾鞘蛋白。这说明orf3基因位于orf6的上游,能够调控orf6的表达。接下来用Real-time PCR相对定量orf3、orf5、orf6和orf17在不同基因敲除菌株中的转录水平,发现orf5在不同敲除菌株中的转录水平没有明显的变化。orf3在P28△orf6(N)菌株中的转录水平没有明显变化而在P28△orf5-6中增加了 61.25倍,说明orf5抑制了 orf3的转录。orf6在P28△orf3菌株中转录水平下降了 99倍,说明orf3促进orf6的转录。orf17在P28△orf6(N)菌株中没有转录,在P28△orf3菌株中转录量下降了 99倍,在P28△orf5-6菌株中转录量增加了 5.32倍,说明orf3和orf6都促进orf17的转录,orf5抑制orf17的转录。为了确定orf3是否直接调控orf6的表达,orf6和orf5是否直接调控尾鞘基因的表达,我们决定通过EMSA进行验证。构建orf3、orf5、orf6的表达载体pET26-ORF3、pET28-ORF5、pET26-ORF6,在E.coli BL21(DE3)菌株中分别异源表达这三个基因,获得带有his标签的重组蛋白。在特定的缓冲液中让纯化的目的蛋白与启动子DNA结合,通过非变性PAGE胶检测,发现ORF6能够与尾鞘基因的启动子结合,说明orf6能够直接调控尾鞘基因的表达。有可能是实验条件没有优化好,暂时没有检测到ORF5和ORF3与目的启动子结合。总之,本论文鉴定了 3个参与maltocinP28尾鞘基因表达的调控基因,其中orf3促进orf6的表达,orf6直接正调控尾鞘基因的表达,orf5则抑制了orf3和尾鞘基因的表达。