番茄红素(Lycopene)是植物中的一种天然色素，属于类胡萝卜素中的一种，它是许多类胡萝卜素生物合成的中间体，经过环化可形成其它类胡萝卜素。番茄红素主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚等植物的果实，茶的叶片以及萝卜、胡萝卜等植物的根部，其中以番茄果实中的番茄红素含量最高，其含量可达到3～14mg／100g。在成熟的番茄果实中，番茄红素悬浮遍布于果肉中。番茄红素是类胡萝卜素中活性最强的抗氧化剂，有延迟衰老的作用，可以预防和缓解多种疾病，且对人体没有任何毒副作用，故被认定为营养型保健食品。番茄红素在西方饮食中非常盛行，已被许多国家批准使用于食品、化装品和药品。因此，培育高番茄红素的番茄品种，是近年来国内外番茄品质育种拘热点。番茄红素在植物细胞中的合成是在质体和叶绿体中进行的，其生物合成的过程为：八氢番茄红素(Psy)在脱氢酶作用下依次脱氢生成六氢番茄红素、链孢红素和番茄红素。番茄红素在番茄红素环化酶(Lcy)的作用下转化为其它类胡萝卜素。如果通过RNAi抑制番茄果实中番茄红素β环化酶基因的表达，就可以阻止番茄红素降解，促进其积累，从而创造高番茄红素的转基因番茄新种质。本实验从番茄基因组中分离了Pds启动子片段，通过农杆菌介导的方法将Pds-GUS基因导入番茄中，研究Pds启动子的表达特性；同时根据RNA聚合酶Ⅱ介导的RNA沉默(RdRP)原理，将番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)片段通过一段内含子构建成dsRNA基因，并用具有果实特异性表达的Pds启动子调控该RNAi基因的表达，导入番茄后研究抑制Lcy基因表达对番茄果实中番茄红素含量的影响。该研究结果可为借助分子改良途径提高番茄果实的番茄红素含量奠定基础。主要研究结果包括以下几个方面：1．番茄Pds启动子的克隆与功能分析根据GenBank中公布的番茄Pds启动子序列(U46919)设计特异引物，从番茄基因组中分离了长1790bp的Pds启动子序列，测序结果表明所分离的Pds启动子序列和GenBank中公布的一致。通过SalⅠ和BamHⅠ酶切将全长Pds启动子插入到pVCT-2020表达载体中，替换掉该载体中GUS基因的35S启动子，构建成携有Pds-GUS基因表达盒的植物基因表达载体。通过农杆菌介导的转基因方法将Pds-GUS基因转入番茄中，获得的转基因番茄的果实、叶片及根经X-Gluc染色5h，70％乙醇脱色后，显微镜下观察照相。结果表明Pds启动子具有果实特异性的特点。2．番茄红素环化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根据GenBank中公布的番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)序列(X86452)设计特异引物，上游引物P166：CTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGCTCGATGCAACTGGCTTCTCTA，通过PCR从番茄基因组中获得了长302bp的Lcy片段，测序结果表明与GenBank公布的一致。3．果实特异性RNAi的植物表达载体的构建通过SalⅠ酶切，补平，再用BamHⅠ酶切后连接，得到Lcy片段反向重复连接的中间克隆载体pMD-srLcy。将pMD-srLcy经BamHⅠ酶切，去磷酸化后与内含子连接，构建RNAi片段的中间克隆载体pMD-RNAi。pMD-RNAi经SalⅠ和Ecl136Ⅱ切下RNAi片段插入到pVCT2020载体中，构建成pVCT-RNAi表达载体。pMD-Pds经SalⅠ和EcoRⅠ切下Pds启动子后，将Pds片段插入到SalⅠ和EcoRⅠ酶切的pVCT-RNAi载体中，构建成pVCT-PdsRNki载体。构建成的pVCT-PdsRNAi表达载体经酶切鉴定，能获得正确的目的带，表明构建的载体正确。4．番茄遗传转化再生体系的建立番茄种子经肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水冲洗掉乙醇；然后在超净台上用10％的次氯酸钠消毒30min，灭菌水漂洗4次后，接种于1／2MS培养基上，暗培养2～3天，待番茄种子发芽后，于25℃，光照强度18001x，16h光／8h暗的光周期条件下培养直到子叶完全展开。切取番茄的子叶和下胚轴，分别接种到MS+1.0mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂的固体培养基上，比较子叶和下胚轴的芽分化能力，结果表明子叶的芽分化能力高于下胚轴。将番茄子叶接种到MS附加不同浓度6-BA(1～3 mg／L)与IAA(0.1～0.3 mg／L)及6-BA(1～3 mg／L)与NAA(0.1～0.3 mg／L)组合的培养基上，筛选适宜芽分化的激素浓度及最佳组合。结果表明在MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂的培养基上番茄子叶的芽诱导率最高，并且诱导芽所需要的时间最短，长出的芽最壮，因此本实验最终采月MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂组合的培养基来诱导番茄子叶发芽。设计不同浓度的IAA(0.2～0.5mg／L)，观察不定芽生根的速度、数量及生根的质量，以确定适于番茄生根的最佳IAA浓度，结果显示幼苗在不同培养基中都能生根，其中以含0.4 mg／LIAA的培养基生根最快，一周后即出现大量不定根，根系比较壮。为了测定外植体对Kan的敏感性，在筛选的最佳诱导培养基中，加入不同浓度的kan(0、10、20、30、40、50、60、70 mg／L)测定外植体的分化情况，每个浓度3次重复，每次重复20个外植体，接种观察不同浓度kan对番茄子叶分化抑制的效果。结果表明当在浓度为60 mg／L的培养基上，有少量愈伤组织形成，以后逐渐白化、死去，不能分化出芽；含40 mg／Lkan的培养基上多数外植体形成较多的愈伤组织，大部分可分化出绿芽，并且生长正常；因此本实验所用番茄材料适宜的筛选压为kan 50mg／L。5．转基因番茄的获得采用农杆菌介导法，将携带pVCT-PdsRNAi表达载体的新鲜的农杆菌菌液用液体MS培养基重悬后，浸染已经在分化培养基上预培养两天的番茄子叶，将经农杆菌浸染的外植体接种到芽诱导培养基(MS+1.0mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+30g／L蔗糖+琼脂6.5g／L)上28℃暗培养2d，然后将外植体转入抑菌培养基(MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+30 g／L蔗糖+300mg／L羧卞青霉素Cb，pH 5.8)上培养7天，然后把抑菌培养7d后的外植体转移到选择培养基(MS+1.0mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+30g／L蔗糖+琼脂6.5g／L+50 mg／L kan+250 mg／L Cb，pH 5.8)上进行选择培养，培养条件为：温度26±2℃，光照时间16h／d，光照强度3，0001x。选择培养2周后，外植体的切口处逐渐分化出抗性不定芽，将这些抗性芽转入(MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+糖30 g／L+琼脂6.5g／L+50 mg几kan+200 mg／L Cb. pH 5.8)新鲜选择培养基中继续进行选择培养，每两周换一次培养基，其间不断的降低Cb的浓度。待抗性苗长到3～4am以上时，从基部切下形成的不定芽，转入MS+0.4 mg／L IAA+30 g／L蔗糖+50 mg／L的Kan的培养基上生根，7～10d后开始长出不定根，等幼苗长到3～4片叶后，将生根后的植株开瓶炼苗3～5d，移栽到人工气候室中让其自然生长直到结果。6．转基因植株的检测通过抗性筛选，本实验共获得了7株转化再生植株，分别提取这7株植株的DNA进行PCR检测，反应体系同扩增Lcy片段一样，反应条件只由72℃延伸1min变为72℃延伸2min外，其他条件不变。其中5株扩增出了预期的条带，表明外源基因已经整合到了番茄基因组中，将鉴定为正确的转基因植株移栽到人工气候室中，让其自然生长直到结果，获得转基因番茄果实。在农杆菌浸染过程中，农杆菌太浓，在后来的培养中外植体容易褐化、坏死；农杆菌太稀获得的抗性植株的机会就减少，因此，应适当掌握农杆菌的浸染浓度，本实验结果认为农杆菌菌液浓度的OD值在0.3～0.6之间是最适合浸染番茄外植体的浓度，同时用液体MS培养基重悬农杆菌是很必要的，可以降低农杆菌对外植体的毒害，增加外植体的成活率。7．转基因番茄中番茄红素含量的测定收获转色期20天后的完全红熟的番茄果实每株两个，研磨成糊以后，每株称取10g番茄糊，加入适量的氯仿在35℃避光提取4小时，离心，转移下层液体至一新的50mL的离心管中，然后向番茄残渣中再加入适量氯仿重复抽提2次，最后用氯仿定容到50mL。将提取的番茄红素溶液迅速用U-1800型紫外分光光度计在502nm的波长下测定番茄红素含量，氯仿做参比，每个材料重复3次，测得一系列吸光度值，取平均值计算番茄红素含量。测定结果表明所获得的5株转基因番茄果实的番茄红素含量都比非转基因番茄果实中番茄红素高，转基因番茄中番茄红素的平均含量是对照的2.1倍，其中1号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多，是对照的2.6倍。