铅是一种常见的环境污染物,长期处于低剂量的铅暴露环境下可以造成人体多个器官的功能异常,其中对神经系统的影响尤为明显。处在生长发育过程中的儿童是铅中毒的易感人群,铅在中枢神经系统中的异常蓄积可导致儿童学习、记忆能力明显下降、认知障碍和发育迟缓等一系列症状。许多研究都建立了发育期铅暴露的大鼠模型,并且都把研究重点集中在铅暴露对海马及相关的空间学习记忆的影响。学习记忆的神经生物学基础主要是通过突触可塑性所实现的,突触传递的改变在突触可塑性中至关重要,而神经传递主要通过突触胞吐发挥功能。可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)复合物是神经元胞吐过程重要的一部分,它主要参与调节突触前膜融合过程。突触小泡膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein 2,VAMP2)是SNARE复合物的重要组成部分,分布于囊泡膜上,突触小体相关蛋白(synaptosomal associated protein of molecular mass 25k D,SNAP25)及突触融合相关蛋白(syntaxin)分布在突触前膜上,三者共同构成SNARE蛋白,在神经递质释放中发挥重要的作用。Micro RNA(mi RNA)是一类由内源基因编码的长约为22个核苷酸左右的小单链RNA家族,它通过与靶基因互补配对在转录后水平促进其降解或抑制翻译发挥作用。研究表明micro RNA在大脑中丰富表达,它可能参与维持正常脑神经功能和动态平衡,如学习记忆,神经元分化,突触可塑性和神经生成等功能。也有报道在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病,帕金森氏病,共济失调,亨廷顿氏病和精神分裂症mi RNA也有差异性表达。本实验室利用micro RNA芯片技术发现发育期铅暴露可导致大鼠海马中mi R-34b等micro RNA表达谱发生变化,提示包括mi R-34b在内的micro RNA分子可能参与了铅神经毒性作用,但是其具体机制并不清楚。本研究是实验室前期工作的延续,以发育期大鼠、大鼠肾嗜铬细胞瘤PC12细胞和小鼠海马神经元HT22细胞为实验对象,研究铅暴露诱导mi R-34b表达的改变及其调节突触小泡膜蛋白VAMP2表达的作用,并探讨mi R-34b调节VAMP2表达在铅影响突触囊泡生成中的作用,研究结果将为阐明铅神经毒性的分子机制提供研究基础。目的:本研究通过建立发育期大鼠慢性铅暴露模型以及PC12细胞、HT22细胞铅暴露模型,研究铅暴露对mi R-34b及其潜在靶分子VAMP2表达的影响,探讨mi R-34b调节VAMP2表达的机制及其在铅影响突触囊泡生成中的作用,阐明mi R-34b/VAMP2通路在铅神经毒性中的作用,为揭示铅神经毒性的分子机制提供研究基础。方法:1.建立铅暴露的动物模型和细胞模型。①动物模型:21日龄雄性SD大鼠随机分为3组:对照组、100ppm铅暴露组和300ppm铅暴露组,每组12只,饮水染铅8周。②细胞模型:采用大鼠肾嗜铬细胞瘤PC12细胞和小鼠海马神经元HT22细胞,铅暴露浓度为0、5、10μmol/L。2.采用Morris水迷宫方法实验检测大鼠空间学习记忆能力。3.采用实时荧光定量q RT-PCR方法检测对mi R-34b和靶蛋白突触小泡膜蛋白vamp2 m RNA的表达水平;采用Western blot方法检测VAMP2蛋白的表达水平。4.采用荧光素酶报告基因系统检测mi R-34b对vamp2 m RNA 3’-UTR区稳定性的影响。5.通过在PC12细胞中转染mi R-34b inhibitor检测其对靶分子VAMP2 m RNA和蛋白表达的影响。6.采用免疫电镜技术观察发育期铅暴露对大鼠海马突触小泡膜蛋白VAMP2表达水平的影响。7.采用流式细胞计数方法检测铅暴露对PC12细胞VAMP2蛋白表达的影响。8.采用透射电镜技术检测发育期铅暴露对大鼠海马突触囊泡形成的影响。结果1.发育期铅暴露影响大鼠空间学习记忆能力利用原子吸收分光光度仪进行血铅浓度测定,结果显示铅暴露组大鼠血铅水平随着暴露时间及剂量增加显著升高。Morris水迷宫结果显示,铅暴露组与对照相比逃避潜伏期明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05);撤除平台后,穿越平台次数与对照组相比较少,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.铅暴露影响mi R-34b的表达实时荧光定量q RT-PCR检测显示,铅暴露组大鼠海马组织中mi R-34b表达量均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),且300ppm铅暴露组高于100ppm铅暴露组,差异具有统计学意义(p<0.05)。在体外实验中铅暴露影响PC12细胞和HT22细胞中mi R-34b的表达,且表达水平随着染铅剂量的增加而升高(p<0.05)。3.mi R-34b调控突触小泡膜蛋白VAMP2的表达采用生物信息学方法对mi R-34b的靶基因进行分析,通过三个靶基因预测网站Targetscan、pic Tar和mi RNA.org等对mi R-34b的靶基因进行预测,筛选出突触小泡膜蛋白VAMP2作为mi R-34b靶分子的可能性较大。通过在PC12细胞中转染mi R-34b的抑制剂,利用q RT-PCR和Western blot方法观察靶分子VAMP2的表达,结果显示VAMP2显著升高,说明mi R-34b能够调节vamp2 m RNA的表达水平。荧光素酶报告基因系统检测显示,mi R-34b能够与vamp2m RNA的3‘-UTR区特异结合影响其稳定性。4.铅暴露通过mi R-34b/VAMP2通路影响大鼠海马区突触囊泡的形成实时荧光定量q RT-PCR和Western blot检测显示,铅暴露组大鼠海马组织中vamp2 m RNA及VAMP2蛋白表达水平均较对照组下降。与对照组相比,PC12细胞和HT22细胞处理24h和48h后,vamp2m RNA表达水平下降,VAMP2蛋白表达水平也低于对照组。流式细胞计数检测显示,铅暴露后PC12细胞中VAMP2蛋白表达水平降低。透射电镜检测结果显示,发育期铅暴露能够显著减少大鼠海马区神经元内突触囊泡的数量;免疫电镜方法检测结果显示,发育期铅暴露后海马区突触结构内VAMP2蛋白表达显著下调。结论:1.铅暴露可以影响大鼠海马组织、PC12细胞及HT22细胞mi R-34b的表达。2.mi R-34b调控突触小泡膜蛋白vamp2 m RNA的稳定性。3.铅暴露通过诱导mi R-34b表达进而影响下游靶分子突触小泡膜蛋白VAMP2的表达以及海马区神经元内突触囊泡的形成。