【摘 要】
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目的:
体外培养人髓核细胞,使用不同浓度的基质金属蛋白酶组织抑制剂-1对髓核细胞进行干预,观察不同浓度的基质金属蛋白酶组织抑制剂-1干预下的体外髓核细胞生物学活性的
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目的:
体外培养人髓核细胞,使用不同浓度的基质金属蛋白酶组织抑制剂-1对髓核细胞进行干预,观察不同浓度的基质金属蛋白酶组织抑制剂-1干预下的体外髓核细胞生物学活性的影响,初步探讨TIMP-1对椎间盘退变缓解或逆转的作用。
方法:体外培养人髓核细胞10例,每例细胞传代后共分6组,以不同浓度的基质金属蛋白酶组织抑制剂.1分别对传代后的髓核细胞进行干预,其中A组为对照组(即TIMP-1浓度为0ng/ml),另5组加入TIMP-1进行干预,浓度分别为(1,10,20,40,80ng/ml),即B组、C组、D组、E组、F组。分别于干预后第2,4,6,8d采用WESTERN BLOTTING技术测定各组Ⅱ型胶原的定量表达。并于第6d对髓核细胞行甲苯胺蓝染色检测髓核细胞中蛋白聚糖的表达,第8d对髓核细胞行细胞免疫荧光染色法测定各组髓核细胞Ⅱ型胶原的表达。
结果:
(1)甲苯胺蓝染色显示:细胞胞浆呈天蓝色,系细胞内蛋白聚糖被甲苯胺蓝深染,越靠近细胞核染色越深。随TIMP-1浓度的增加,染色结果亦逐渐加深。于40ng/ml组染色最深。
(2)细胞免疫荧光染色显示:染色后于倒置荧光显微镜下显示髓核细胞呈淡绿色或绿色荧光,荧光主要分布于细胞胞浆,而细胞核部分几乎无荧光显示。随着TIMP-1浓度上升,荧光强度逐渐增强(P<0.05),且TIMP-1浓度为40ng/ml(E组)时荧光强度达到最大值;F(80ng/ml)组与E组相比荧光强度明显减弱。
(3)WESTERNBLOTTING显示:随着TIMP-1作用时间的延长Ⅱ型胶原的表达量逐渐上升(p<0.001)。且随着TIMP-1浓度上升,Ⅱ型胶原的含量也逐渐增加(P<0.001),TIMP-1浓度为40ng/ml(E组)时Ⅱ型胶原的含量达到最大值;F(80ng/ml)组与E组相比Ⅱ型胶原的含量明显减少。
结论:
(1)TIMP-1干预后,髓核细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达量明显上升,提示其可有效缓解或逆转椎间盘髓核细胞的退变。
(2)随着TIMP-1作用浓度的上升,髓核细胞中Ⅱ型胶原的蛋白表达量也逐渐上升。当TIMP-1的浓度在40ng/ml时,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达量达到峰值;TIMP-1浓度在80ng/ml时,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达量不升反降,提示TIMP-1的最佳作用浓度应该在40ng/ml左右;过量的TIMP-1可能存在细胞毒作用。
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