目的胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)最常见的恶性肿瘤,起源于神经胶质细胞,包括星形细胞系瘤,少突胶质细胞系肿瘤,混合性胶质细胞瘤,室管膜瘤等。据统计,胶质瘤约占颅内原发性肿瘤的35.26-60.96%(平均44.69%)。由于肿瘤分化不全呈侵袭性生长,手术切除不能够彻底,预后较差。即使进行放化疗也都很难有效根除,病人平均生存期约14.6个月,一般不到两年,极大威胁了人们的生命健康。因此,寻找新的胶质瘤治疗方式成为近20年来研究的热点。随着对中枢神经系统及胶质瘤免疫特性认识的逐渐深入,生物免疫治疗已成为第四种治疗模式,是治疗颅内肿瘤最有前景的新疗法。DC疫苗由于安全,有效及低毒,是胶质瘤免疫治疗的重点。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前发现的功能最强大的专职抗原呈递细胞,形态上具有树突状结构,主要组织相容性复合体及共刺激分子如CD86、CD80等的表达水平较高,能够有效摄取并行抗原处理,将之递呈与T淋巴细胞,从而具有启动作用,激发初次细胞免疫应答,引发一系列免疫反应。研究表明,多种方法制备的DC有一定的抗瘤效果。目前致敏DC的抗原有纯化的蛋白质、抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤DNA或RNA等。由于胶质瘤抗原性较弱,且不同个体的胶质瘤间存在异质性,目前研究尚未发现其特异性公共抗原,使DC疫苗目前只能够行个体化治疗,无法实现疫苗的公共化。找到一种在胶质瘤中表达较为广泛的特异性蛋白成为目前脑胶质瘤疫苗研究急需解决的问题。IL-13Ra2是由380个氨基酸残基组成的膜受体,编码基因定位于xq24,属红细胞生成素受体家族。近年来,研究发现IL-13Ra2其在恶性肿瘤细胞尤其是胶质瘤中存在特异性高表达,且恶性程度越高其表达越强,而在正常组织及器官中几乎不表达,由此指出IL-13Ra2是恶性肿瘤的一种受体蛋白,作为一种可能的胶质瘤特异性标志物,有可能在胶质瘤的诊断及治疗方面做出贡献。国外研究已发现IL-13Ra2具有明显的免疫原性及抗原性,可应用于免疫疗法针对恶性胶质瘤细胞,在抗胶质瘤研究中极具潜力,使用IL-13Ra2蛋白致敏的DC疫苗可能同样具有杀伤肿瘤细胞的效果,为DC疫苗的公共化做出贡献。近年来研究发现胶质瘤中存在少部分具干细胞特征的细胞,其具备以下几种特点：无限增殖及自我更新能力、多向分化潜能及高致瘤性、表达干细胞特异性标记。该细胞被称为肿瘤干细胞,高表达多种抗凋亡基因及耐药基因,多处于细胞周期的相对静止期,对放化疗不敏感,不易杀灭。Ignatova发现该类细胞表达CD133及Nestin, Singh等则发现,小鼠颅内接种100个CD133+细胞即可成瘤。胶质瘤干细胞是肿瘤复发的根源。随肿瘤干细胞研究的深入,其作为DC抗原致敏物致敏DC疫苗,诱导出的T细胞抗肿瘤免疫反应明显强于传统DC制备方法得到的疫苗,证明肿瘤干细胞在免疫治疗中具有抗原性,为免疫治疗研究打开了新的视角。由于肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源,针对肿瘤干细胞的免疫治疗为根治胶质瘤带来希望。本实验通过检测IL-13Ra2蛋白在脑胶质瘤及正常脑组织中的表达情况,使用IL-13Ra2抗原肽及胶质瘤干细胞的细胞裂解物致敏异体同血型树突状细胞制备DC疫苗,刺激T淋巴细胞,观察是否能有效的杀伤胶质瘤细胞,并与传统胶质瘤全细胞抗原致敏的DC疫苗效果相比较,从而探讨IL-13Ra2蛋白及肿瘤干细胞在胶质瘤免疫治疗中的重要性。采用统计学软件SPSS17.0进行数据统计学分析。方法本实验分为三部分：第一部分IL-13Ra2蛋白在脑胶质瘤及U251细胞中的表达：收集取得的手术标本制成组织蜡块,u251细胞复苏培养制成细胞爬片,采用免疫组化SABC法(细胞免疫组化及组织免疫组化)检测59例脑胶质瘤5例正常脑组织及U251细胞系中IL-13Ra2蛋白的表达,并对其与肿瘤恶性程度的关系进行统计学分析。第二部分胶质瘤细胞及肿瘤干细胞的培养：收集术中取得的胶质瘤标本,剪切消化,在含血清培养基(DMEM高糖+10%人体血浆)条件下行胶质瘤细胞原代培养；原代胶质瘤细胞以无血清培养法在干细胞培养基(DMEM/F12+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)条件下培养原代胶质瘤干细胞,生成肿瘤球后行肿瘤干细胞分化实验及流式细胞术检测CD133阳性细胞的表达率。U251细胞系细胞复苏及细胞培养(DMEM高糖+10%FBS)。第三部分：DC诱导制备及DC疫苗诱导的细胞杀伤效应检测：取正常人外周血,淋巴分离液分离,离心机离心后吸取单个核细胞以1640培养基+10%人体血浆37。C,5%CO2的恒温培养箱内培养培养2小时,收集非粘附细胞后用含有粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养基诱导培养,培养过程中倒置显微镜下观察形态,流式细胞仪检测DC表面标记物CD14、CD83、CD80、CDla、CD86及HLA-DR。取实验第二部分培养的原代胶质瘤细胞,胶质瘤干细胞及U251细胞,反复冻融裂解后离心,制备全细胞抗原。将IL-13Ra2蛋白及上述所得肿瘤全细胞抗原及肿瘤干细胞抗原分别与成熟DC混合,培养箱中培养24小时,获得不同DC疫苗。用人T细胞富集液孵育同源外周血后以淋巴细胞分离液分离并离心,取得T淋巴细胞,T淋巴细胞与DC疫苗共培养后行T细胞增殖实验及T细胞杀伤实验,比较不同DC疫苗的肿瘤的杀伤效果。统计学分析：结果以均值土标准差表示,多组分析采用单因素方差分析,两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果IL-13Ra2不在正常的脑组织中表达,而59例胶质瘤组织中有33例IL-13Ra2表达阳性(阳性率55.9%),差异显著。胶质瘤中IL-13Ra2的表达在高度恶性胶质瘤与低级别胶质瘤之间的差异有统计学意义。U251细胞系IL-13Ra2表达阳性。U251细胞及胶质瘤培养成功,在含血清培养基中显微镜下可见其细胞呈梭形,部分呈星形及多角形,胞质透亮,贴壁单层生长。生长迅速,约1周传代一次。4代后可见细胞突起较多,多角形占大部分。无血清干细胞培养基内培养1周多悬浮生长,形成悬浮肿瘤克隆球,折光性较好,流式检测细胞标记CD133阳性,当接种于含血清培养基后肿瘤细胞球逐渐贴壁,细胞逐渐迁出,贴壁分化的细胞形状与原代培养肿瘤细胞相似。在细胞因子GM-CSF和IL-4作用下可成功从人外周血单核细胞中诱导出DC,相差显微镜镜下可见单核细胞贴壁生长,悬浮细胞逐渐增多,体积增大不规则,有典型树突状形态突起,符合成熟形态。流式细胞仪检测可见PBMC-标志物CD14低表达,DCS表面标志物表达率增加,(特征性表面标记CD8387.1%、CDla81%,高表达功能相关抗原CD8078%、CD8684.2%及HLA-DR83%)提示人外周血中诱导到大量高纯度成熟DC。细胞体外杀伤实验结果表明,与单纯DC组相比,IL-13Ra2,肿瘤全细胞抗原及肿瘤干细胞抗原致敏的DC细胞均能明显刺激T细胞增殖,有效杀灭胶质瘤细胞。相比其他实验组,肿瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗活化的CTL胶质瘤的杀伤效应更强(P<0.05), IL-13Ra2致敏DC组与肿瘤全细胞抗原致敏DC组相比效果无明显差异(P>0.05),在以脑肿瘤干细胞为靶细胞的体外杀伤实验中干细胞抗原裂解物对肿瘤细胞的杀伤力最强,与IL-13Ra2致敏DC组及单纯DC细胞组相比差异有显著的统计学意义(P<0.001)。而IL-13Ra2致敏DC组杀伤率较低,与单纯DC组相比无统计学意义。(P>0.05)。DC与T细胞比例1：10时刺激能力及杀伤活性最强。结论IL-13Ra2蛋白在正常脑组织中不表达,而在胶质瘤及U251细胞系中存在广泛表达,且表达与恶性程度有关,是一种理想的胶质瘤免疫治疗靶标；原代胶质瘤组织及U251细胞系在无血清培养条件下可成功培养出足够数量的胶质瘤干细胞；人类外周血来源单个核细胞在体外GM-CSF和IL-4联合诱导培养下可获得充足的成熟DC树突状细胞,为DC的肿瘤免疫治疗提供了细胞来源。肿瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗能有效刺激抗原特异性CTL,杀伤胶质瘤细胞功能较IL-13Ra2致敏DC疫苗及肿瘤全细胞抗原致敏DC更强。而IL-13Ra2致敏DC疫苗与肿瘤全细胞抗原致敏DC疫苗也有明显的胶质瘤细胞杀伤效果,有潜在临床运用价值。