【摘 要】
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副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为一种日益得到广泛关注的食源性致病菌,其主要毒力因子之一的类脂A（Lipid A）的结构和合成途径尚未得到证明。类脂A是革兰氏阴性菌外膜主要成分的脂多糖的基本结构之一,也是内毒素的活性成分。已有的研究表明,V.parahaemolyticus中存在四个类脂A次级脂肪酸链的转移酶,其中VP＿RS01045是大肠杆菌lpx M的同源基因。然
【基金项目】
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“十三五”国家重点研发计划项目《重要食源性致病菌耐药机制及传播规律研究（2017YFC1600100）》；
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副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为一种日益得到广泛关注的食源性致病菌,其主要毒力因子之一的类脂A（Lipid A）的结构和合成途径尚未得到证明。类脂A是革兰氏阴性菌外膜主要成分的脂多糖的基本结构之一,也是内毒素的活性成分。已有的研究表明,V.parahaemolyticus中存在四个类脂A次级脂肪酸链的转移酶,其中VP＿RS01045是大肠杆菌lpx M的同源基因。然而不同于绝大多数革兰氏阴性菌,V.parahaemolyticus存在三个大肠杆菌lpx L的同源基因,它们分别是VP＿RS00880、VP＿RS08045和VP＿RS12170。本课题利用多重基因敲除法研究V.parahaemolyticus ATCC 33846中编码次级脂肪酸链转移酶的基因,并主要通过ESI/MS探究突变株的类脂A结构变化及次级脂肪酸链转移酶的多重功能,并探究它们生长状况、外膜性质和耐药性等的变化。主要研究结果如下:（1）以不同组合形式敲除了V.parahaemolyticus的4个编码次级脂肪酸链转移酶的基因,分别构建了缺失两个lpx L同源基因的VPW005、VPW006和VPW007,缺失全部三个lpx L同源基因的VPW008。最后在VPW005、VPW007和VPW008基因组中成功敲除VP＿RS01045,构建了三株同时缺失VP＿RS01045和两个及以上lpx L同源基因的突变株VPW009、VPW010和VPW011。提取ATCC 33846及各突变株的类脂A,利用高分辨率质谱分析它们的类脂A结构,发现除VPW010和VPW011外的所有菌株均能同时合成推测的七酰化和八酰化类脂A的结构。VPW010主要合成推测的七酰化类脂A结构,而VPW011能同时合成推测的六酰化和七酰化的类脂A结构。（2）生物信息学分析结果显示,VP＿RS00880和VP＿RS12170分别与VP＿RS01045具有26%和23%的同源性。VP＿RS00880和VP＿RS12170编码的酶是能同时在类脂A的2’位和3’位添加次级脂肪酸链的双功能酶,其中VP＿RS00880编码的酶负责转运C14:0的脂肪酸链,VP＿RS12170编码的酶负责转运3-OH C14:0的脂肪酸链。此外,还可能存在一个未知的次级脂肪酸链转移酶负责向类脂A的2’位添加C14:0脂肪酸。（3）与野生型相比,多基因缺失株中VP＿RS01045编码的酶和八酰化的类脂A结构可能对V.parahaemolyticus的正常生长至关重要,缺失了VP＿RS01045的VPW009、VPW010和VPW011生长变得缓慢。在细胞形态上,同样可能由于VP＿RS01045的缺失,VPW009、VPW010和VPW011在细胞长度上更短,细胞间粘附性变弱,因此VP＿RS01045编码的酶很可能也是它们维持正常细胞形态和细胞间粘附性的关键。（4）类脂A结构改变对V.parahaemolyticus的外膜产生了一定影响。VP＿RS01045的缺失明显降低了多基因突变株的表面疏水性,表明VP＿RS01045编码的酶对维持V.parahaemolyticus表面疏水性十分重要。VPW011可能由于缺乏VP＿RS00880、VP＿RS08405、VP＿RS12170和VP＿RS01045而产生的六酰化和七酰化类脂A而形成对多粘菌素的耐药性。
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