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目的:恶性脑胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤。血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)严重限制了治疗脑胶质瘤的化疗药物向肿瘤组织的转运,极大的影响了化疗效果。因此,选择性开放BTB对于提高恶性脑胶质瘤的化疗疗效至关重要。PIWI蛋白是Argonaute蛋白家族中的一个亚家族,与肿瘤细胞的细胞增殖、凋亡、侵袭等行为相关。PIWI-interacting RNAs(piRNAs)是近年来新发现的一类不同于 microRNAs(miRNAs)和 small interfering RNAs(siRNAs)的小 RNA 分子,分子大小集中在26~31nt,特异性地同PIWI蛋白结合,具有基因沉默及调控和维持种系DNA稳定的功能。PIWI/piRNAs复合体能够调节转座子抑制,表观遗传状态和RNA裂解。目前,PIWIL3/piRNA(DQ590704)(piR-DQ590704)复合体对 BTB 通透性的作用尚未见报道。长链非编码RNAs(lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,具有调控肿瘤相关基因的表达和肿瘤生物学行为的作用。有研究发现,LINC00657在缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞中高表达。然而,LINC00657在人脑微血管内皮细胞内的表达以及是否参与调节BTB通透性,目前尚未见报道。MiRNAs是一类长度约为18-24个核苷酸的单链非编码小RNA,通过与靶基因mRNAs的3’非翻译区(3’UTR)结合,从而导致mRNAs的降解或翻译过程的抑制,进而在转录后水平上负性调控基因的表达。已有研究表明,miR-205在胶质瘤组织和细胞系中低表达,组织中的表达水平与胶质瘤级别呈负相关。然而,miR-205在人脑微血管内皮细胞中的表达与功能尚未见报道。本研究主要旨在明确PIWIL3/piR-DQ590704通过LINC00657途径调控血肿瘤屏障通透性的作用与相关机制,为胶质瘤的治疗提供新的策略。方法:1.人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3细胞、人脑胶质瘤细胞系U87细胞及人胚肾细胞系HEK293T细胞的培养。2.体外血肿瘤屏障(BTB)模型的建立。3.应用实时定量聚合酶链反应检测piR-DQ590704、LINC00657、miR-205在正常人脑微血管内皮细胞和胶质瘤微血管内皮细胞中的内源性表达水平。4.应用实时定量聚合酶链反应和Western blot检测PIWIL3、NFIB、NFIX在正常人脑微血管内皮细胞和胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平。5.构建PIWIL3过表达稳定转染细胞系、LINC00657表达沉默稳定转染细胞系、NFIB和NFIX过表达和表达沉默稳定转染细胞系。6.瞬时转染piR-DQ590704过表达质粒、piR-DQ590704沉默质粒以及它们各自的阴性对照模拟物;瞬时转染miR-205过表达质粒、miR-205沉默质粒以及它们各自的阴性对照模拟物。7.应用跨内皮电阻(TEER)值和辣根过氧化物酶(HRP)渗出量评估血肿瘤屏障通透性变化。8.应用Western blot和免疫荧光检测紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平及其在细胞内分布的变化。9.应用双荧光素酶报告基因分析确定piR-DQ590704与LINC00657之间的靶向结合,miR-205与LINC00657之间的靶向结合,miR-205和NFIB的3’UTR区之间的靶向结合,miR-205和NFIX的3’UTR区之间的靶向结合。10.通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验证实PIWIL3、piR-DQ590704和LINC00657存在相互作用,LINC00657和miR-205存在相互作用。11.应用染色质免疫沉淀分析NFIB与紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5启动子的直接作用;NFIX与紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5启动子的直接作用。结果:1.成功建立体外BTB模型,获得人脑胶质瘤微血管内皮细胞(Glioma endothelial cells,GECs)。2.PIWIL3、piR-DQ590704在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中的表达水平较正常脑微血管内皮细胞明显降低,LINC00657在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中的表达水平较正常脑微血管内皮细胞明显升高,上调PIWIL3和piR-DQ590704通过下调LINC00657的表达显著降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加BTB通透性。3.MiR-205在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中的表达水平较正常脑微血管内皮细胞明显降低,过表达miR-205能够增加BTB通透性并伴随紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平下降,以及改变细胞内分布。4.沉默LINC00657表达能够上调miR-205的表达水平,LINC00657与miR-205存在靶向结合作用,LINC00657通过负性调控miR-205的表达,降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加BTB通透性。5.NFIB和NFIX在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中的表达水平较正常脑微血管内皮细胞升高,分别下调NFIB和NFIX表达能够增加BTB的通透性并伴随紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平下降,以及细胞内分布的改变。6.NFIB和NFIX是miR-205的靶基因,miR-205通过负性调控NFIB和NFIX的表达,降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加BTB通透性。7.NFIB和NFIX与紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的启动子直接结合。结论:PIWIL3、piR-DQ590704和miR-205在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中低表达,LINC00657、NFIB和NFIX在胶质瘤微血管内皮细胞GECs中高表达;上调PIWIL3和piR-DQ590704通过下调LINC00657的表达显著降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin 和 claudin-5 的表达,增加 BTB 通透性;LINC00657通过上调 miR-205的表达显著降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加BTB通透性;过表达miR-205通过靶向结合转录因子NFIB和NFIX下调其表达,降低紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加BTB通透性;转录因子NFIB和NFIX与紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的启动子直接结合。