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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohns disease，CD)。本病以肠道炎症和粘膜组织损伤为特征，其病因及发病机制尚未完全明确。目前得到基本认同的观点为:环境因素作用于遗传易感者，在肠道共生菌的参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致免疫反应及炎症过程。肠道粘膜免疫系统在IBD肠道炎症发生、发展及转归过程中始终发挥重要作用，因此调节肠道免疫反应，恢复肠道粘膜免疫耐受成为IBD治疗的关键。 树突状细胞(Dendritic cell，DCs)是目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，是唯一能够激活初始型T细胞的APC，研究表明DCs是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和不同的功能状态，不仅能够递呈抗原激活免疫细胞诱发免疫应答，而且可以诱导胸腺清除自身反应性细胞、分化调节性T细胞维持自身免疫耐受，因此DCs成为介导免疫应答与耐受的关键。DCs在成熟过程中表型和功能会发生明显变化，非成熟型或半成熟型DCs表现为耐受活性，这种活性随着DCs的成熟而转变为免疫原性。 胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)由Friend等于1994年从胸腺基质细胞中首次分离鉴定，随着研究的深入，TSLP在免疫应答中的作用引起了人们的广泛关注。TSLP可直接活化DCs，微弱上调DCs表面的HLA-DR和CD86的表达，强烈诱导共刺激分子CD40和CD80的表达，并选择性激活病理性Th2型细胞反应，从而在过敏、炎症及免疫疾病中扮演重要的角色。IBD作为肠道慢性炎症性疾病，其发生发展与免疫、炎症及过敏反应密切相关，目前TSLP在IBD发病中的作用尚未明确，有研究表明与过敏性疾病中TSLP的致病性不同，TSLP对于肠道炎症具有保护作用，TSLPR基因敲除小鼠建立的IBD动物模型，获得了较正常对照组更为严重的肠道炎症反应。Besin G等应用TSLP-conditioned-DCs成功治疗了小鼠的糖尿病，提示TSLP条件化的DCs具有耐受性表型，而TSLP-conditioned-DCs是否对于IBD具有治疗作用目前国内外均未见报道，为了回答此问题并深入探讨TSLP在肠道免疫中的作用及机制，我们进行如下研究。 材料和方法: 一、材料 2-3周龄的纯系雌性NOD小鼠，SPF级，周龄2～3w，体重10～12g;雌性Balb/c小鼠，SPF级，周龄8～10w，体重22～25g，由中国医科大学实验动物中心提供，室内温度20±2℃，相对湿度为50％，自然光线采光，日照时间为12小时，常规饮水，普通专用饲料喂养。 二、主要试剂 mouse GM-CSF Peprotech公司;mouse IL-4 Peprotech公司;mouse TSLPRD公司;胎牛血清Hyclone公司;RPMI1640细胞培养液Hyclone公司;FITC-CD11c荧光抗体eBioscience公司;PE-CD40荧光抗体eBioscience公司;PE-CD80荧光抗体eBioscience公司;PE-CD86荧光抗体eBioscience公司;PE-MCHII荧光抗体eBioscience公司;FITC-CD4荧光抗体eBioscience公司;PE-IFN-γ荧光抗体eBioscience公司;PE-IL-4荧光抗体eBioscience公司;PE-CD25荧光抗体eBioscience公司;小鼠TNF-α ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-12 ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-10 ELISA试剂盒RD公司;脂多糖sigma公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS) sigma公司;小鼠IFN-γ ELISA试剂盒RD公司;SYBR Prime Script Real-Time PCR Kit（TakaRa，DRR063s，大连宝生物工程有限公司）;目的基因和内参引物DNA（TakaRa Custom DNA，由宝生物工程（大连）有限公司设计）;小鼠IL-1β ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-4 ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-17 ELISA试剂盒RD公司。 三、主要仪器和设备 倒置显微镜;低温高速离心机(Eppendof);超低温冰箱;超净工作台;流式细胞仪(FACS Calibur，BD Bioscience);全自动ELISA分析仪(BioTek，ELx808);Light Cycler Real Time PCR扩增仪(Roche) 四、实验方法 （一）小鼠骨髓源性树突状细胞的体外培养及表型鉴定 采集NOD小鼠骨髓细胞，于体外应用GM-CSF诱导分化，培养细胞分为三组，一组不加干预，另两组于第六日分别给予TSLP及LPS刺激，继续培养24小时后收集细胞应用流式细胞术检测细胞表型，并收集细胞培养上清液检测IL-10、IL-12、TNF-α的表达。 （二）应用TNBS建立小鼠炎症性肠病模型 分别应用100mg/kgTNBS+无水乙醇、150mg/kgTNBS+50％乙醇及100mg/kgTNBS+25％乙醇溶液灌肠，建立Balb/c小鼠炎症性肠病动物模型。造模后观察小鼠一般状态，DAI评分，大体形态损伤评分，病理组织学评分，了解不同配比灌肠液诱导IBD动物模型的效果及疾病严重程度的变化趋势，收集肠系膜淋巴结细胞及脾脏淋巴细胞进行体外培养，三日后收集细胞培养上清液应用ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的表达，收集细胞应用流式细胞术检测肠系膜淋巴结及脾脏淋巴细胞中CD4+IFN-γ+及CD4+IL-4+双阳性T细胞的表达率。 （三）干预实验 分别应用PBS、TSLP-DCs、TSLP-腹腔注射、TSLP灌肠、imDCs于IBD小鼠模型建立后3小时进行干预治疗，并连续三日给药，每日观察小鼠生存率、一般状态、DAI评分，三日后处死小鼠，评估大体损伤程度，取远端结肠组织进行H-E染色观察病理改变进行病理组织评分;取中段结肠组织均浆后应用ELISA法检测IL-17、IL-1β、IL-23、IL-4的表达;取近端结肠组织应用real-time PCR法检测IL-4、IL-17、IL-23、IL-1β、INF-γ、IL-10、IL-6、Foxp3的表达;收集肠系膜淋巴结细胞，培养三日后收集细胞应用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T（regulatory t cell Tregs）细胞的表达率。 （四）统计分析 所有数据采用Mean±SD来表示，差异比较采用SPSS17.0软件进行分析，组间比较采用独立样本的t检验及方差分析，p＜0.05差异有统计学意义。 结论: 1、应用GM-CSF于体外可诱导小鼠骨髓细胞产生树突状细胞。 2、TSLP处理的DCs表现为半成熟DCs表型，其细胞培养液中分泌较高浓度抑制性细胞因子IL-10，而炎症性细胞因子TNF-α及IL-12的浓度明显降低。 3、应用TNBS+乙醇一次性灌肠可建立IBD动物模型，100mg/kg TNBS+无水乙醇一次性灌肠建立的小鼠模型肠道炎症明显，而且小鼠存活率高，造模后第三日疾病严重程度最明显。 4、应用100mg/kgTNBS+无水乙醇建立的IBD小鼠模型，结肠炎症以Th1型细胞反应为主，结合其大体损伤及病理改变提示该方案建立的动物模型与人类的Crohn病相似。 5、TSLP-DCs干预治疗明显提高了IBD小鼠的存活率，小鼠一般状态、DAI评分、大体损伤评分及病理组织评分明显好于对照组，TSLP-腹腔注射组加重了小鼠结肠炎症改变，TSLP灌肠及imDCs治疗组改善了IBD小鼠的结肠炎症，但其疾病评分及病理组织评分不优于TSLP-DCs治疗组。 6、TSLP-DCs干预治疗促进小鼠结肠组织Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）的产生，而明显抑制了Th1型（IL-1β、IL-6、INF-γ）及TH17型（IL-17、IL-23）细胞因子的产生;TSLP-DCs干预治疗组小鼠肠系膜淋巴结调节性T细胞表达率明显增高，且调节性T细胞的特异性转录因子Foxp3的表达明显增高。提示TSLP-DCs干预治疗改善了IBD小鼠的结肠炎症可能通过调节Th1/Th2及Th17/Tregs的平衡而获得。 7、与TSLP-腹腔注射组加重小鼠肠道炎症反应不同，TSLP灌肠组改善了IBD小鼠的结肠炎症，提示TSLP于不同的组织器官作用不同，其机制可能与组织微环境及DCs的亚群相关，由此可见进一步研究肠道DCs的功能特征成为进一步研究的方向。