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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohns disease,CD)。本病以肠道炎症和粘膜组织损伤为特征,其病因及发病机制尚未完全明确。目前得到基本认同的观点为:环境因素作用于遗传易感者,在肠道共生菌的参与下,启动了肠道免疫及非免疫系统,最终导致免疫反应及炎症过程。肠道粘膜免疫系统在IBD肠道炎症发生、发展及转归过程中始终发挥重要作用,因此调节肠道免疫反应,恢复肠道粘膜免疫耐受成为IBD治疗的关键。 树突状细胞(Dendritic cell,DCs)是目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC),是唯一能够激活初始型T细胞的APC,研究表明DCs是一类异质性细胞群体,具有不同的亚群和不同的功能状态,不仅能够递呈抗原激活免疫细胞诱发免疫应答,而且可以诱导胸腺清除自身反应性细胞、分化调节性T细胞维持自身免疫耐受,因此DCs成为介导免疫应答与耐受的关键。DCs在成熟过程中表型和功能会发生明显变化,非成熟型或半成熟型DCs表现为耐受活性,这种活性随着DCs的成熟而转变为免疫原性。 胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)由Friend等于1994年从胸腺基质细胞中首次分离鉴定,随着研究的深入,TSLP在免疫应答中的作用引起了人们的广泛关注。TSLP可直接活化DCs,微弱上调DCs表面的HLA-DR和CD86的表达,强烈诱导共刺激分子CD40和CD80的表达,并选择性激活病理性Th2型细胞反应,从而在过敏、炎症及免疫疾病中扮演重要的角色。IBD作为肠道慢性炎症性疾病,其发生发展与免疫、炎症及过敏反应密切相关,目前TSLP在IBD发病中的作用尚未明确,有研究表明与过敏性疾病中TSLP的致病性不同,TSLP对于肠道炎症具有保护作用,TSLPR基因敲除小鼠建立的IBD动物模型,获得了较正常对照组更为严重的肠道炎症反应。Besin G等应用TSLP-conditioned-DCs成功治疗了小鼠的糖尿病,提示TSLP条件化的DCs具有耐受性表型,而TSLP-conditioned-DCs是否对于IBD具有治疗作用目前国内外均未见报道,为了回答此问题并深入探讨TSLP在肠道免疫中的作用及机制,我们进行如下研究。 材料和方法: 一、材料 2-3周龄的纯系雌性NOD小鼠,SPF级,周龄2~3w,体重10~12g;雌性Balb/c小鼠,SPF级,周龄8~10w,体重22~25g,由中国医科大学实验动物中心提供,室内温度20±2℃,相对湿度为50%,自然光线采光,日照时间为12小时,常规饮水,普通专用饲料喂养。 二、主要试剂 mouse GM-CSF Peprotech公司;mouse IL-4 Peprotech公司;mouse TSLPRD公司;胎牛血清Hyclone公司;RPMI1640细胞培养液Hyclone公司;FITC-CD11c荧光抗体eBioscience公司;PE-CD40荧光抗体eBioscience公司;PE-CD80荧光抗体eBioscience公司;PE-CD86荧光抗体eBioscience公司;PE-MCHII荧光抗体eBioscience公司;FITC-CD4荧光抗体eBioscience公司;PE-IFN-γ荧光抗体eBioscience公司;PE-IL-4荧光抗体eBioscience公司;PE-CD25荧光抗体eBioscience公司;小鼠TNF-α ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-12 ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-10 ELISA试剂盒RD公司;脂多糖sigma公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) sigma公司;小鼠IFN-γ ELISA试剂盒RD公司;SYBR Prime Script Real-Time PCR Kit(TakaRa,DRR063s,大连宝生物工程有限公司);目的基因和内参引物DNA(TakaRa Custom DNA,由宝生物工程(大连)有限公司设计);小鼠IL-1β ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-4 ELISA试剂盒RD公司;小鼠IL-17 ELISA试剂盒RD公司。 三、主要仪器和设备 倒置显微镜;低温高速离心机(Eppendof);超低温冰箱;超净工作台;流式细胞仪(FACS Calibur,BD Bioscience);全自动ELISA分析仪(BioTek,ELx808);Light Cycler Real Time PCR扩增仪(Roche) 四、实验方法 (一)小鼠骨髓源性树突状细胞的体外培养及表型鉴定 采集NOD小鼠骨髓细胞,于体外应用GM-CSF诱导分化,培养细胞分为三组,一组不加干预,另两组于第六日分别给予TSLP及LPS刺激,继续培养24小时后收集细胞应用流式细胞术检测细胞表型,并收集细胞培养上清液检测IL-10、IL-12、TNF-α的表达。 (二)应用TNBS建立小鼠炎症性肠病模型 分别应用100mg/kgTNBS+无水乙醇、150mg/kgTNBS+50%乙醇及100mg/kgTNBS+25%乙醇溶液灌肠,建立Balb/c小鼠炎症性肠病动物模型。造模后观察小鼠一般状态,DAI评分,大体形态损伤评分,病理组织学评分,了解不同配比灌肠液诱导IBD动物模型的效果及疾病严重程度的变化趋势,收集肠系膜淋巴结细胞及脾脏淋巴细胞进行体外培养,三日后收集细胞培养上清液应用ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的表达,收集细胞应用流式细胞术检测肠系膜淋巴结及脾脏淋巴细胞中CD4+IFN-γ+及CD4+IL-4+双阳性T细胞的表达率。 (三)干预实验 分别应用PBS、TSLP-DCs、TSLP-腹腔注射、TSLP灌肠、imDCs于IBD小鼠模型建立后3小时进行干预治疗,并连续三日给药,每日观察小鼠生存率、一般状态、DAI评分,三日后处死小鼠,评估大体损伤程度,取远端结肠组织进行H-E染色观察病理改变进行病理组织评分;取中段结肠组织均浆后应用ELISA法检测IL-17、IL-1β、IL-23、IL-4的表达;取近端结肠组织应用real-time PCR法检测IL-4、IL-17、IL-23、IL-1β、INF-γ、IL-10、IL-6、Foxp3的表达;收集肠系膜淋巴结细胞,培养三日后收集细胞应用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T(regulatory t cell Tregs)细胞的表达率。 (四)统计分析 所有数据采用Mean±SD来表示,差异比较采用SPSS17.0软件进行分析,组间比较采用独立样本的t检验及方差分析,p<0.05差异有统计学意义。 结论: 1、应用GM-CSF于体外可诱导小鼠骨髓细胞产生树突状细胞。 2、TSLP处理的DCs表现为半成熟DCs表型,其细胞培养液中分泌较高浓度抑制性细胞因子IL-10,而炎症性细胞因子TNF-α及IL-12的浓度明显降低。 3、应用TNBS+乙醇一次性灌肠可建立IBD动物模型,100mg/kg TNBS+无水乙醇一次性灌肠建立的小鼠模型肠道炎症明显,而且小鼠存活率高,造模后第三日疾病严重程度最明显。 4、应用100mg/kgTNBS+无水乙醇建立的IBD小鼠模型,结肠炎症以Th1型细胞反应为主,结合其大体损伤及病理改变提示该方案建立的动物模型与人类的Crohn病相似。 5、TSLP-DCs干预治疗明显提高了IBD小鼠的存活率,小鼠一般状态、DAI评分、大体损伤评分及病理组织评分明显好于对照组,TSLP-腹腔注射组加重了小鼠结肠炎症改变,TSLP灌肠及imDCs治疗组改善了IBD小鼠的结肠炎症,但其疾病评分及病理组织评分不优于TSLP-DCs治疗组。 6、TSLP-DCs干预治疗促进小鼠结肠组织Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的产生,而明显抑制了Th1型(IL-1β、IL-6、INF-γ)及TH17型(IL-17、IL-23)细胞因子的产生;TSLP-DCs干预治疗组小鼠肠系膜淋巴结调节性T细胞表达率明显增高,且调节性T细胞的特异性转录因子Foxp3的表达明显增高。提示TSLP-DCs干预治疗改善了IBD小鼠的结肠炎症可能通过调节Th1/Th2及Th17/Tregs的平衡而获得。 7、与TSLP-腹腔注射组加重小鼠肠道炎症反应不同,TSLP灌肠组改善了IBD小鼠的结肠炎症,提示TSLP于不同的组织器官作用不同,其机制可能与组织微环境及DCs的亚群相关,由此可见进一步研究肠道DCs的功能特征成为进一步研究的方向。