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胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一,其发生发展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。DNA启动子高甲基化被认为是抑癌基因失活的最重要机制之一。寻找和验证新的抑癌基因对揭示胃癌新的分子发病机制,确定生物学靶标干预癌变有重要意义。HoxD10属Hox基因家族的一员,其表达产物是重要的转录因子。HoxD10在胚胎发育过程中细胞分化和形态发育控制起重要作用,也是课题组前期通过CpG岛和cDNA微阵列分析筛选到的可能与胃癌相关的新的候选基因,其与胃癌发生发展的关系需要深入研究。本研究将通过体内外实验明确HoxD10对胃癌生物学行为(细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移)的影响；探讨并揭示胃癌HoxD10的基因启动子是否被甲基化修饰及启动子甲基化检测对胃癌诊治的潜在价值；采用表达谱芯片技术筛选HoxD10基因调控的下游关键基因并进行验证,进一步阐明HoxD10对胃癌抑制作用及相关凋亡信号通路的分子调控机制。研究步骤1. HoxDl0在胃癌中的表达及对胃癌的生物学行为的影响qPCR检测33对胃癌及正常组织中HoxD10基因mRNA表达水平：PCR和Western blot检测8种胃癌细胞株中的HoxD10的表达；②克隆形成实验和MTS实验观察过表达HoxD10对胃癌细胞增殖的影响：③采用流式细胞仪分析HoxD10对胃癌细胞凋亡和细胞周期的影响；Transwell实验研究HoxD10对胃癌细胞迁移及侵袭的影响；④裸鼠皮下荷瘤模型验证过表达HoxD10对胃癌生长的影响。2.胃癌中HoxD10基因的启动子甲基化研究及其对胃癌诊治的潜在的价值①对不同胃癌细胞株进行了5-Aza-dC去甲基化处理,RT-PCR和Western blot分别检测药物处理前后HoxD10的表达情况；②甲基化特异PCR (MSP)检测不同胃癌细胞株启动子甲基化情况；并检测正常胃组织、胃癌前状态和胃癌不同阶段HoxD10启动子甲基化的频度。3. HoxD10调控靶基因及凋亡相关信号通路的研究①利用基因表达谱芯片技术筛选HoxD10调控的下游靶基因。对其中9个候选靶基因在稳定转染HoxD10的MKN28胃癌细胞中进行qPCR验证；Western blot检测HoxD10对IGFBP3和凋亡调控通路关键蛋白(caspase3和caspase8)表达的影响。研究结果1. HoxD10能抑制胃癌的生长和侵袭HoxD10在胃癌组织中mRNA表达水平较正常组织明显下调(p<0.001),在系列胃癌细胞株中均呈现显著低表达或沉默表达。②过表达HoxD10能明显抑制胃癌细胞株AGS和MKN28的增殖(p<0.01)③过表达HoxD10能促进细胞凋亡,抑制细胞周期S期,并显著抑制AGS细胞的迁移和侵袭(p<0.01)④裸鼠胃癌移植瘤实验发现过表达HoxD10能显著抑制肿瘤的生长(p<0.01)2.启动子DNA甲基化是HoxD10表达下调的重要调控机制①胃癌细胞株中HoxD10均呈下降或沉默表达,经启动子去甲基化(5-aza)药物处理后HoxD10恢复表达或表达增强。②MSP检测发现HoxD10基因启动子在3个胃癌细胞株(MKN28、MKN45和NCI-N87)中全部甲基化,在1个胃癌细胞株(AGS)中有部分甲基化。③胃癌组织中HoxD10启动子甲基化频度最高(85.7%,24／28),胃癌前状态(肠上皮化生)组织亦存在高频度甲基化(60%,18／30),正常组织无甲基化或低甲基化(0／10)3. HoxD10调控多个重要下游基因,并参与相关凋亡信号通路调控①筛选到HoxD10的下游调控基因：34个上调和50个下调基因。这些基因主要参与细胞增殖、凋亡和侵袭等重要细胞生物学功能。qRT-PCR证实其中HCLS1、 ANP32A、PDGFRL、IGFBP3和CXCL9的mRNA水平明显升高,而RAC2、 NTS、 KRT5和TUSC3的mRNA水平明显下降,其结果与基因芯片表达谱吻合。②过表达HoxD10后,AGS和MKN28细胞中IGFBP3表达水平明显升高,Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8的蛋白表达水平亦明显升高。研究结论1.体内外实验证实HoxD10在胃癌中表达显著下调,过表达HoxD10能抑制胃癌生长和肿瘤侵袭。HoxD10有望成为新的胃癌抑制基因。2.发现HoxD10基因在胃癌中表达下调与启动子DNA甲基化密切相关。HoxD10启动子甲基化检测有望作为胃癌前病变和癌变监测的重要生物标记物,HoxD10启动子去甲基化有可能成为潜在的癌变干预手段。3.筛选到HoxD10调控的系列下游基因,这些基因参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学过程。并发现HoxD10具有上调IGFBP3候选靶基因,激活Caspase3和Caspase8凋亡信号途径,促进胃癌细胞凋亡的分子作用机制。