【摘 要】
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第一部分 在MEFs细胞中,Gαi介导电离辐射诱导的信号通路活化的作用机制目的既往有许多研究表明细胞经电离辐射后可以激活胞内PI3K-Akt-mTOR、Erk-MAPK等信号通路,这些信号通路的活化通过促进DNA损伤修复、抗凋亡等途径使细胞存活于照射,造成辐射抗拒。然而,这些通路的靶点抑制剂放射增敏的临床转化并不顺利,电离辐射激活这些通路的具体机制尚不清楚。我们之前的研究已经证实Gαi可以介导EG
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第一部分 在MEFs细胞中,Gαi介导电离辐射诱导的信号通路活化的作用机制目的既往有许多研究表明细胞经电离辐射后可以激活胞内PI3K-Akt-mTOR、Erk-MAPK等信号通路,这些信号通路的活化通过促进DNA损伤修复、抗凋亡等途径使细胞存活于照射,造成辐射抗拒。然而,这些通路的靶点抑制剂放射增敏的临床转化并不顺利,电离辐射激活这些通路的具体机制尚不清楚。我们之前的研究已经证实Gαi可以介导EGFR、VEGFR等受体酪氨酸激酶诱导的下游PI3K-Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路的活化,进而促进肿瘤进展。因而这一部分我们想验证Gαi在电离辐射诱导的信号转导中是否同样起关键作用,及其相关的分子机制。方法1.采用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts,MEFs）作为工具细胞,运用敲除、敲减、外源性导入等各种基因策略干预细胞中Gαi蛋白的表达,蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）检测Gαi蛋白对电离辐射诱导Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路活化的影响。2.蛋白质免疫印迹法检测干预Gαi对Gab1活化的影响,及敲除Gab1对电离辐射诱导Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路活化的影响。结果1.在MEFs细胞中,抑制Gαi1和/或Gαi3的蛋白表达会抑制辐射诱导的Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路的活化;抑制Gαi2对辐射诱导信号通路的活化没有影响;外源性导入Gαi1和Gαi3会增强辐射诱导信号通路的活化。2.在电离辐射所诱导的信号通路中,Gab1位于Gαi蛋白的下游,并且敲除Gab1会抑制电离辐射诱导的Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路的活化。结论在MEFs细胞中,Gαi1/3介导电离辐射诱导的Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路的活化。Gab1位于Gαi的下游,与Gαi共同参与电离辐射的信号转导。第二部分 Gαi1/3对体外胶质瘤细胞系放射敏感性的影响目的近90%的胶质母细胞瘤存在PI3K-Akt-mTOR通路的过度活化。该通路通过促生存、促代谢、抗凋亡、促进DNA损伤修复等机制增强肿瘤的放射抗性。因此这一部分我们想研究Gαi1/3是否通过介导Akt/Erk信号转导进而影响胶质瘤的放射敏感性。方法1.在人胶质瘤细胞系U87-MG和U251中,用shRNA慢病毒双敲低Gαi1和Gαi3,免疫蛋白印迹法检测Gαi蛋白对电离辐射诱导Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路活化的影响。2.在人胶质瘤细胞系中,用EdU染色、克隆形成实验检测敲低Gαi1和Gαi3对电离辐射后细胞增殖、克隆形成能力的影响;γH2AX免疫荧光检测敲低Gαi1和Gαi3对电离辐射后DNA损伤修复的影响;用蛋白质免疫印迹法检测Gαi对DNA损伤反应通路中的关键蛋白ATM和ATR活化的影响;用Annexin V/PI双染检测敲低Gαi1和Gαi3对电离辐射后细胞凋亡的影响。结果1.在人胶质瘤细胞系U87-MG和U251中,shRNA慢病毒敲低Gαi1和Gαi3抑制辐射诱导的Akt-mTOR及Erk-MAPK信号通路的活化。2.在人胶质瘤细胞系中,shRNA慢病毒敲低Gαi1和Gαi3导致电离辐射后细胞增殖、克隆形成能力减弱,DNA损伤修复能力减弱,细胞凋亡比例增加。结论沉默Gαi1/3通过抑制电离辐射诱导的信号转导来增强体外胶质瘤细胞系的放射敏感性。第三部分 在人胶质瘤组织中,Gαi1和Gαi3的表达水平与患者临床指标及预后的相关性分析目的既往的研究中我们发现,在胶质瘤肿瘤组织中Gαi1和Gαi3的表达水平要显著高于癌旁正常组织。这一部分的实验我们想进一步探究Gαi在胶质瘤肿瘤组织中的表达水平与患者临床指标及生存预后的相关性。方法购买人胶质瘤组织芯片,免疫组化检测Gαi1和Gαi3的表达,并分别做蛋白表达与胶质瘤患者临床指标及预后的相关性分析。结果在人胶质瘤组织中,Gαi1和Gαi3的表达水平与肿瘤WHO分级呈正相关,蛋白表达水平高伴随分级升高。胶质瘤肿瘤组织中Gαi1和Gαi3的蛋白表达水平与患者预后相关,蛋白表达水平高者总生存率及无病生存率均低,预后差。同时胶质瘤肿瘤组织中Gαi1和Gαi3的表达呈正相关。结论胶质瘤肿瘤组织中Gαi1/3的表达与患者肿瘤分级及生存预后相关。
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