论文部分内容阅读
高脂饮食（High fat diet,HFD）对认知功能的影响暂无确切结论,高脂和高蛋白质食品在高温干热的加工过程中会生成大量晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）,摄入过量膳食AGEs可能导致认知功能损伤。现代西方饮食模式中高脂和高膳食AGEs通常共存,对于高脂联合膳食AGEs饮食能否比单独高脂饮食诱导更严重的认知功能损伤还不明确。运动是一种有益、高效且低成本的防治认知功能损伤的非药物干预措施。探讨自主运动对高脂联合膳食AGEs诱导的认知功能损伤的影响对以生活方式为基础的认知功能障碍防治策略的实施具有重要意义。目的:以不同月龄的雄性C57BL/6J小鼠为模型,探讨与单独高脂饮食相比,高脂联合膳食AGEs饮食能否诱导更严重的认知功能障碍及自主运动的干预效果,且饮食和自主运动干预对认知功能的影响是否存在年龄差异,以及表观遗传、神经炎症、生物节律、肠道菌群途径在上述干预中所发挥的可能作用。方法:共64只9周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,其中一半小鼠随机分为年轻对照组（YCON组,常规AIN-93M饲料）;年轻高脂饮食组（YHFD组,高脂饲料）;年轻高脂饮食联合膳食晚期糖基化终末产物组（YAGE组,AGEs含量升高的高脂饲料）;年轻高脂饮食联合膳食晚期糖基化终末产物加自主运动干预组（YEX组,AGEs含量升高的高脂饲料,并设置跑轮装置供其自主运动）,每组8只,干预周期为20周。另外32只雄性C57BL/6J小鼠普通饲料喂养20周后随机分为中年对照组（ACON组）;中年高脂饮食组（AHFD组）;中年高脂饮食联合膳食晚期糖基化终末产物组（AAGE组）;中年高脂饮食联合膳食晚期糖基化终末产物加运动干预组（AEX组）,每组8只,干预周期和干预方式与年轻组一致。动物饲养结束后,进行Morris水迷宫实验测定小鼠的认知功能。随后处死小鼠,分离小鼠大脑皮质、结肠和肠内容物,并进行如下指标的检测:1.1表观遗传:Western blot检测大脑皮质中DNA甲基转移酶:甲基转移酶3a（Dnmt3a）和甲基转移酶3b（Dnmt3b）;组蛋白甲基化关键蛋白:组蛋白H3第9位赖氨酸上的二甲基化（H3K9me2）;DNA去甲基化路径关键蛋白:甲基胞嘧啶双加氧酶2（Tet2）和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）;qPCR法检测大脑皮质中Tet2 mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）Malat1、Sox2ot、Gm15477和Snhg1的表达。1.2神经炎症:Western blot检测大脑皮质中星胶细胞激活标志物:胶质纤维酸性蛋白（GFAP）;小胶质细胞激活标志物:离子钙接头蛋白分子1（Ibα1）;AGEs受体:炎症型受体RAGE和清除型受体抗寡糖基转移酶-48（OST48）:磷酸化核因子（p-NFκB）、Nod样受体蛋白3（NLRP3）和白介素-18（IL-18）等神经炎症关键标志物的表达。1.3生物节律:Western blot检测大脑皮质中沉默信息调节因子1（SIRT1）、芳香烃受体核转运样蛋白1（BMAL1）、时钟蛋白（CLOCK）、周期素2（PER2）、隐花色素1（CRY1）、隐花色素2（CRY2）、REV-ERBα等生物节律关键标志物的表达。1.4肠道通透性及结肠病理改变:Western blot检测结肠中紧密连接组分闭合蛋白（Occludin）和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的表达。H＆E染色观察结肠的病理变化,测量结肠绒毛的长度。1.5肠道菌群:运用16S rRNA高通量测序技术测定小鼠肠道菌群,Spearman相关分析肠道菌群的多样性及组间差异菌属与Morris水迷宫标志物的相关性。结果:2.1认知功能2.1.1年轻组:定位航行试验期间,YHFD组小鼠第2天和第5天的逃避潜伏期较对照组显著延长（P＜0.05）,YAGE组小鼠第1天和第2天逃避潜伏期较YHFD组显著缩短（P＜0.05）,而YEX组小鼠第2天和第5天逃避潜伏期较YHFD组显著缩短（P＜0.05）。空间探索试验期间,YHFD和YAGE组小鼠与对照组相比穿越平台次数、在目标象限停留的时间和距离均显著减少（P＜0.05）,平均接近度显著升高（P＜0.05）;与YHFD组相比,YEX组穿越平台次数显著增加,平均接近度显著减少（P＜0.05）;与YAGE组相比,YEX组在目标象限内停留的时间和距离均显著增加（P＜0.05）。2.1.2中年组:定位航行试验期间,与对照组相比,AHFD组在第2-5天和AAGE组小鼠在第2、3、5天的逃避潜伏期显著延长（P＜0.05）;AEX组小鼠在第2、4、5天的逃避潜伏期与AHFD组小鼠相比显著缩短（P＜0.05）,最后一天的逃避潜伏期与AAGE组小组相比也显著缩短（P＜0.05）。空间探索试验期间,与对照组相比,AAGE组小鼠穿越平台次数和在目标象限停留的路程显著减少（P＜0.05）,平均接近度显著增加（P＜0.05）;与AHFD组相比,AAGE组在目标象限停留的路程显著减少（P＜0.05）;AEX组小鼠穿越平台的次数和平均接近度指标均优于AHFD和AAGE组（P＜0.05）。2.2表观遗传2.2.1年轻组:与对照组相比,YHFD组Dnmt3a和H3K9me2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,YAGE组Dnmt3a、Dnmt3b和H3K9me2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与 YAGE 组相比,YEX 组 Dnmt3a、Dnmt3b 和 H3K9me2 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）。Tet2和p-AMPK蛋白表达水平在各组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。2.2.2中年组:（1）Western blot:与对照组相比,AHFD组Dnmt3a、Tet2蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,AAGE组Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,p-AMPK蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,AEX组H3K9me2蛋白表达量显著下降（P＜0.05）,Tet2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与AHFD组相比,AAGE组Tet2蛋白表达量显著下降（P＜0.05）,AEX组H3K9me2蛋白表达量显著下降（P＜0.05）;与AAGE组相比,AEX组Dnmt3a蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）,Tet2和p-AMPK蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。（2）Dot blot:AAGE组的5 mC表达水平显著低于其余三组,5 hmC表达水平显著低于ACON组和AEX组（P＜0.05）。（3）qPCR:与对照组相比,AAGE组lncRNAMalat1相Snhg1表达量显著升高（P＜0.05）,AEX 组 lncRNAMalat1 表达量显著升高（P＜0.05）;AAGE 组Tet2 mRNA 和 lncRNA Sox2ot 表达量显著低于 AHFD 组（P＜0.05）,lncRNASnhg1显著高于AHFD组（P＜0.05）;AEX组Tet2mRNA和lncRNA Sox2ot表达量显著高于AHFD组和AAGE组（P＜0.05）,lncRNA Snhg1表达量显著低于AHFD组和AAGE组（P＜0.05）,lncRNAGm15477在各组间表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。2.3神经炎症2.3.1年轻组:与对照组相比,YAGE组GFAP、RAGE和NLRP3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,OST48蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,YEX组RAGE蛋白表达量显著升高（P＜0.05）;与YAGE组相比,YEX组GFAP和NLRP3蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,OST48蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。2.3.2中年组:与对照组相比,AHFD组的Ibα1和IL-18蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,AAGE组的OST48蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,p-NF κB、NLRP3、IL-18蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,AEX组RAGE蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;与AHFD组相比,AAGE组的OST48蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,p-NF κB蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,AEX组的Ibα1、RAGE蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;与 AAGE 组相比,AEX 组的 Ibα1、RAGE、p-NF κB、NLRP3、IL-18的蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）。2.4生物节律2.4.1年轻组:YAGE组的CLOCK蛋白表达水平显著低于对照组和YHFD组（P＜0.05）,CRY1蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。SIRT1、BMAL1、PER2、CRY2和REV-ERBα蛋白表达水平在各组未观察到显著差异（P＞0.05）。2.4.2中年组:AHFD组BMAL1、CLOCK、PER2蛋白表达量显著高于对照组（P＜0.05）,REV-ERBα蛋白表达量显著低于对照组（P＜0.05）;AAGE组SIRT1和REV-ERBα蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.05）;AEX组BMAL1、CLOCK、PER2蛋白表达水平显著低于AHFD组和AAGE组（P＜0.05）。2.5肠道通透性和结肠病理改变2.5.1年轻组:各组小鼠间Occludin和ZO-1的蛋白表达量无差异（P＞0.05）。2.5.2中年组:AAGE组的Occludin和ZO-1蛋白表达量显著低于对照组（P＜0.05）;AHFD、AAGE和AEX组结肠绒毛的长度均显著短于对照组（P＜0.05）,AAGE组结肠绒毛长度最短,显著短于ACON组、AHFD组和AEX组（P＜0.05）;在AHFD和AAGE的结肠中观察到坏死和溃疡性变化以及粘膜萎缩和绒毛破坏,而ACON的绒毛完整,没有明显的上皮细胞损伤,自主运动干预改善了肠粘膜结构受损的情况。2.6肠道菌群2.6.1年轻组:（1）多样性分析:与对照组相比,YHFD组的ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数显著降低（P＜0.05）;与YHFD组相比,YAGE组的ACE和Chao1指数显著升高（P＜0.05）,YEX组ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数显著升高（P＜0.05）。各组间β多样性无显著分开趋势。（2）相关性分析:杆菌纲（Bacilli）与平均接近度负相关,与在目标象限停留时间正相关。变形菌纲（Epsilonproteobacteria）、弯曲菌目（Campylobacterales）与平均接近度正相关,与穿越平台次数负相关。螺杆菌属（Helicobacter）与平均接近度以及穿越目标象限次数均负相关。2.6.2中年组:（1）多样性分析:与对照组相比,AHFD组和AAGE组的ACE和Chao1指数均显著升高（P＜0.05）;AHFD、AAGE和AEX组的菌群组成结构与对照组有显著分开趋势。（2）相关性分析:丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichale）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和Allobaculum属与平均接近度指标负相关,而与穿越平台的次数正相关,放线菌门（Actinobacteria）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）和红蝽菌目（Coriobacteriales）与在目标象限的游泳距离正相关。结论:3.1高脂饮食与高脂联合膳食AGEs饮食对年轻C57BL/6J小鼠和中年C57BL/6J小鼠的学习能力均造成损伤;且在中年小鼠中,与高脂饮食相比,高脂联合膳食AGEs饮食对小鼠记忆能力的负面影响更大;自主运动能够改善不同生命阶段由联合饮食诱导的认知功能障碍。3.2在年轻小鼠中,高脂联合膳食AGEs饮食可能通过升高大脑皮质中Dnmt3a、Dnmt3b和H3K9me2的表达,诱导神经炎症,下调CLOCK和CRY1时钟蛋白的表达,增加肠道有害菌（Epsilonproteobacteria、Campylobacterales和Helicobacter）的丰度进而诱导认知功能障碍。自主运动可能通过调节DNA甲基化过程,下调GFAP和NLRP3并上调OST48的表达缓解神经炎症以及降低有害菌Epsilonproteobacteria、Campylobacterales和Helicobacter的丰度而改善认知功能。3.3在中年小鼠中,高脂联合膳食AGEs饮食可能主要通过阻碍大脑皮质中DNA去甲基化过程,增强NF-κB和NLRP3的激活以及破坏肠道通透性而诱导认知功能障碍。自主运动通过升高Tet2、5 mC和5 hmC的表达从而促进DNA去甲基化,抑制NF-κB和NLRP3活化以及调节RAGE-OST48轴,重新平衡昼夜时钟蛋白（包括BMAL1、CLOCK、PER2和REV-ERBα）的表达来恢复认知功能;此外自主运动能够增加肠道中有益微生物（Erysipelotrichi、Erysipelotrichales、Erysipelotrichaceae 和 Allobaculum）的丰度并保护肠道屏障,进一步发挥保护认知功能的作用。