【摘 要】
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背景:Zyxin是一种粘附斑相关蛋白,在细胞运动、增殖和发育过程中发挥重要作用。Zyxin在不同类型的癌症中发挥不同的作用,但目前还没有Zyxin在胃癌中的相关研究。目的:本文的目的是研究Zyxin在胃癌发展过程中是否具有一定的调控作用。方法:首先通过Western blot检测73对不同临床分期的胃癌病人组织样本中Zyxin的相对表达量来探究Zyxin是否在胃癌发展过程中具有显著差异性表达。为研
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背景:Zyxin是一种粘附斑相关蛋白,在细胞运动、增殖和发育过程中发挥重要作用。Zyxin在不同类型的癌症中发挥不同的作用,但目前还没有Zyxin在胃癌中的相关研究。目的:本文的目的是研究Zyxin在胃癌发展过程中是否具有一定的调控作用。方法:首先通过Western blot检测73对不同临床分期的胃癌病人组织样本中Zyxin的相对表达量来探究Zyxin是否在胃癌发展过程中具有显著差异性表达。为研究Zyxin对胃癌发展过程的具体调控作用,本文检测了三种胃癌细胞系MKN45、N87和AGS细胞中Zyxin的表达水平来探究其与胃癌细胞恶性程度的关系。本文通过构建Zyxin过表达的胃癌细胞株来检测Zyxin过表达对干细胞标志物以及上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物表达水平的影响:通过Transwell实验和划痕实验来检测胃癌细胞迁移和侵袭能力;通过细胞增殖测定和软琼脂集落形成实验来检测胃癌细胞体外增殖能力和锚定非依赖性生长能力;通过在培养基中添加特异性化疗药物来检测胃癌细胞药物敏感性;通过裸鼠皮下种瘤实验来检测胃癌细胞体内致瘤能力。最后,为了进一步研究Zyxin与EMT过程的作用机制,我们通过免疫共沉淀实验来检测Zyxin与去乙酰化酶SIRT1是否发生物理结合,通过向细胞内添加SIRT1抑制剂烟酰胺（NAM）来研究SIRT1对EMT进程的影响。结果:1.对73对不同临床分期的胃癌病人癌组织和邻近癌旁组织样本中Zyxin蛋白的表达进行Western blot检测,结果显示,Zyxin在晚期胃癌组织中的相对表达量（癌组织/癌旁组织）显著下调;2.RT-qPCR和Western blot结果显示Zyxin在恶性程度最高的MKN45细胞中表达量最低,而在恶性程度较低的N87和AGS细胞中表达量较高,提示Zyxin表达水平与胃癌细胞的恶性程度成反比;3.Zyxin在MKN45细胞中过表达后导致上皮细胞标志物钙粘蛋白E-Cadherin上调而间充质细胞标志物波形蛋白Vimentin下调,此外,EMT促进因子SNAI1和SNAI2显著下调,而EMT抑制因子GRHL2和OVOL2显著上调,提示Zyxin过表达后EMT进程受到了抑制;4.Zyxin在MKN45细胞中的过表达导致CD44和OCT4下调而CD24上调,提示Zyxin抑制了胃癌细胞的干性;5.Transwell实验和划痕实验结果显示Zyxin在MKN45细胞中的过表达导致细胞迁移、侵袭能力显著下降;6.Zyxin在MKN45或N87细胞中过表达导致细胞体外增殖速率和锚定非依赖性生长能力显著下降,并且Zyxin过表达的胃癌细胞对化疗药物更加敏感;7.Zyxin在MKN45细胞中过表达导致胃癌细胞在裸鼠皮下形成肿瘤的体积和重量显著下降,并抑制了肿瘤中CD44的表达;8.免疫共沉淀（IP）结果显示,Zyxin和SIRT1在MKN45细胞中发生物理结合。WB/RT-qPCR结果表明,在MKN45细胞中过表达Zyxin上调了去乙酰化酶SIRT1的表达水平而不影响另一类去乙酰化酶HDAC1的表达水平。我们进一步发现,SIRT1的上调降低了组蛋白H3 K9和K23位点的乙酰化水平,从而抑制EMT正调节分子SNAI1/2的表达。结论:Zyxin在晚期胃癌样本中的相对表达量下调,可作为胃癌分期的标志物。在胃癌细胞中过表达Zyxin抑制了胃癌细胞的干性和EMT进程,并抑制了胃癌细胞体外增殖、迁移侵袭的能力,增加了胃癌细胞对化疗药物的敏感性。此外,在MKN45细胞中过表达Zyxin抑制了胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。我们的机制研究发现,Zyxin在MKN45细胞中与去乙酰化酶SIRT1结合,并且在MKN45细胞中过表达Zyxin后明显上调SIRT1的表达水平,从而降低组蛋白H3 K9和K23位点的乙酰化水平,抑制转录因子SNAI1/2的表达,最终抑制EMT进程。综上所述,本文首次证明粘附斑蛋白Zyxin可通过抑制胃癌干细胞的干性和EMT进程来负性调控胃癌的发展,或可为新的预防和治疗途径提供契机。
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