急性禁食会导致肝细胞中的氧化应激水平升高并诱导肝脏中大量的脂肪堆积,本研究探讨了肝脏关键水通道蛋白8（AQP8）在禁食过程中对能量代谢和肝脏病理生理的影响。目的:明确AQP8在小鼠肝脏中的定位分布及其在禁食模型中的表达变化,探索AQP8在禁食诱导的肝脏脂肪变性中的具体作用与机制,为临床上治疗由糖脂代谢紊乱引起的疾病提供新的思路。方法:1、对AQP8-Flag转基因小鼠的肝组织进行冰冻切片,通过免疫荧光明确AQP8在小鼠肝脏中的定位。2、利用AQP8-Flag转基因小鼠,通过禁食不同时间点明确AQP8在小鼠肝脏中的表达变化。3、利用野生型和AQP8敲除小鼠尾部组织,抽取其DNA对小鼠基因型进行鉴定。4、利用HE和油红O染色评估禁食诱导的肝脏组织学变化,利用甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、总胆固醇（T-CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、胆汁酸（TBA）、β-羟基丁酸试剂盒检测小鼠禁食前后的肝脏、血清及白色脂肪组织（WAT）中影响脂类代谢的相关参数,评估AQP8敲除对脂质代谢的影响。5、利用DHE染色、免疫印迹法、实时荧光定量PCR技术和相关生化试剂盒检测小鼠禁食过程中氧化应激的变化,评估AQP8敲除对氧化应激的影响。6、利用实时荧光定量PCR技术、免疫印记法分析禁食过程中肝脏成脂基因、脂肪酸氧化、脂解基因和相关蛋白如Ppar-α、Sirtl、Atgl等,以及WAT中脂解基因、脂肪酸转运基因的表达情况,探究AQP8敲除影响脂代谢的具体作用机制。7、利用PAS染色、实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法分析禁食过程中糖原、血糖及胰岛素的变化,评估AQP8在糖代谢中的作用。8、利用荧光探针染色和免疫印迹法评估AQP8敲除对自噬的影响。9、通过给野生型小鼠注射抗氧化剂（NAC）,评估抗氧化剂对禁食诱导的肝脏脂肪变性的影响,以及AQP8敲除是否通过缓解氧化应激起保护作用。结果:1、通过Flag免疫荧光示踪转基因小鼠肝脏AQP8的表达定位,结果表明AQP8主要定位于肝细胞毛细胆管膜,表达呈以肝小叶为单位的选择性分布,此外在肝细胞内和细胞连接处亦可见AQP8-Flag荧光,提示AQP8也可能存在于细胞内膜泡结构和参与细胞连接的形成。2、在小鼠禁食的过程中,AQP8的表达显著下调。正常生理状态下小鼠肝脏中约有70%的肝小叶表达AQP8,随着禁食时间的延长,AQP8表达逐渐降低,直至降到50%左右为止。3、提取野生型和AQP8敲除型小鼠尾部DNA进行基因鉴定,确认小鼠品系以及基因型正确。4、通过对比分析野生型和AQP8敲除型小鼠的禁食造模以及脂质代谢情况,结果显示AQP8敲除能有效保护禁食诱导的肝脏脂肪变性。5、对比禁食过程中野生型和AQP8敲除型小鼠肝脏氧化应激水平的变化,结果表明AQP8敲除能显著增强抗氧化能力并缓解氧化应激。6、qPCR和免疫印迹结果显示,AQP8敲除能显著增强禁食过程中肝脏的脂肪酸氧化、脂解作用,但不影响WAT中脂肪的分解以及脂肪酸的转运。7、PAS染色、免疫印迹结果显示AQP8敲除诱导禁食后肝脏的糖异生、糖原分解减弱,胰岛素敏感性增强。8、荧光探针染色、免疫印迹结果显示AQP8敲除诱导禁食后肝脏（线粒体）自噬增强。9、对比分析野生型小鼠注射抗氧化剂（NAC）前后禁食造模的情况,结果表明抗氧化能力增强可以保护禁食诱导的肝脏脂肪变性,且AQP8敲除通过缓解肝脏氧化应激起保护作用。结论:线粒体是脂肪酸分解代谢的主要场所,在禁食的过程中,线粒体氧化增强,同时伴随着大量自由基的产生,从而影响细胞正常的功能和代谢稳态。AQP8敲除通过缓解肝脏氧化应激、增强肝脏中脂肪酸的β氧化、脂解和自噬作用,减轻了禁食诱导的肝脏脂肪变性,揭示了 AQP8在营养剥夺条件下对脂质代谢起负面调节的作用。其潜在的作用机制是,作为一种过氧化物通道蛋白,AQP8的缺乏阻碍了 H2O2从线粒体向细胞质的释放,这同时也诱导了线粒体自噬的增强,从而改善了细胞整体的氧化还原状态。研究意义:本论文的完成明确了 AQP8敲除对禁食诱导的肝脏脂肪变性的保护作用,特别强调了 AQP8通过介导H2O2的转运在调节氧化应激方面的关键作用。该研究从整体水平、细胞水平与分子水平确证了水通道蛋白8（AQP8）表达减少通过缓解氧化应激从而改善了糖脂代谢紊乱的作用及其深入的机制研究,为寻找安全、有效的保肝药物提供新的靶点,也为临床上抗氧化剂的使用提供科学依据。