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胸腺五肽(thymopoietin pentapcptide,TP-5)是胸腺生成素Ⅱ(Thymopoieti-n Ⅱ)上的活性中心第32位~36位氨基酸序列(-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-),具有胸腺生成素Ⅱ的全部生理功能,是具有重要免疫调节功能和极具应用价值的药物多肽。目前,临床应用的TP-5为化学合成的线状多肽,存在半衰期短,体内稳定性差,易被蛋白酶降解等问题,严重限制了其在临床上的应用。 为提高多肽的活性和稳定性,本研究首次尝试采用基因工程手段,将蛋白内含肽可诱导剪切功能和非保护多肽硫酯环合技术相结合,实现新型重组环状胸腺五肽结构类似物cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)[以下简称cTP]的制备。cTP属于六肽环,其线性前体的结构设计是在胸腺五肽序列的N端添加了一个半胱氨酸残基。与线性多肽相比,活性环肽由于主链呈环状结构,具有一定的构象约束作用,使其构象更加稳定;由于没有所谓氨基端和羧基端,其抗酶解能力强于线性多肽。因此理论上环肽cTP比线性肽TP-5具有更高的生物利用度与更强的生物活性,更具有药用开发价值。 试验设计并合成编码6个氨基酸的cTP线性前体基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTP转化E.coli ER2566构建工程菌cTP-ER2566,IPTG诱导实现由几丁质结合域纯化标签(Chitin binding domain,CBD)、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-Inteinl-cTP-Intein2-CBD)的表达。 在实验室水平优化工程菌cTP-ER2566的发酵参数。初步的探索结果表明:1%甘油作为碳源,培养菌体密度至A600达到0.5-1.0时加入IPTG至工作浓度0.4mmol/L,30℃诱导表达3-4h,可保证目的融合蛋白的可溶性高效表达。以实验室研究为参考,利用5L发酵罐发酵,3L发酵液收获湿菌102g,其中目的融合蛋白表达量达到33—35%,可溶性成分占可溶性总蛋白的29%。 几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后,改变pH值和温度诱导inteinl在其C端切割,硫醇试剂——巯基乙磺酸(MESNA)诱导intein2在其N端切割,释放出N末端为Cys,C端具硫酯键的重组cTP线性硫酯前体,通过非保护多肽硫酯环合实现环肽生成。激光飞行质谱结果显示纯化产物的分子量为764.4Dal,与环肽的理论值相符,环化效率初步检测达到95%以上。免疫活性检测结果显示,环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性(P<0.01)和促进B细胞抗体生成