论文部分内容阅读
背景病理性心肌肥大是导致心力衰竭的重要因素之一,阐明病理性心肌肥大发生发展的机制,寻找有效的干预靶点是亟待解决的重要问题。我们的前期研究表明,TLR4/IL-1R介导的MyD88依赖的TRAF6/NF-κB信号通路在压力过负荷诱导的心肌肥大中发挥着重要的作用,但具体的分子机制和关键的调控因子尚不明确。ECSIT是一种在心肌、骨骼肌中高表达的蛋白,可参与TLR4/IL-1R介导的TRAF6/NF-κB信号通路调控。然而,ECSIT是否可在心血管疾病的发生发展中发挥作用尚不清楚。因此,本研究探讨了 ECSIT在压力过负荷诱导心肌肥大中的作用,并着重研究了其机制是否与ECSIT蛋白对TLR4/IL-1R介导的TRAF6/NF-κB信号通路的调控相关。目的1.明确ECSIT在压力过负荷所致的心肌肥大中的作用。2.明确ECSIT在AngⅡ诱导心肌细胞肥大中的作用。3.阐明ECSIT在心肌肥大发生发展中的分子调控机制。方法1.在体动物实验采用小鼠TAC复制左心室压力过负荷诱导的心肌肥大模型。为了明确TAC所致心肌肥大与ECSIT的关联性,取C57BL/6小鼠分别进行TAC手术或假手术,术后2周检测小鼠心脏结构和功能的改变及心肌组织中ECSIT蛋白和mRNA表达的改变情况。为了明确ECSIT在TAC所致心肌肥大中的作用,取4-5周龄的C57BL/6小鼠通过尾静脉注射AAV9-ECSIT突变体腺相关病毒(AAV9-shEC)抑制心肌组织ECSIT蛋白表达,并以注射等剂量AAV9-shScr作为无关序列对照,4周后进行TAC手术或假手术。实验分为4组:假手术组(sham)、TAC组、TAC+AAV9-shScr组、TAC+AAV9-shEC组,术后2周检测小鼠心肌组织中ECSIT表达的变化及心肌结构与功能的改变。2.体外细胞实验压力过负荷所致机械应力等刺激可诱导Ang Ⅱ的分泌,激活AngⅡ型受体,进而参与压力过负荷诱导的心肌肥大的调控。因此,本课题采用AngⅡ诱导体外培养出生1-3天SD大鼠心肌细胞肥大模型展开研究。为了观察AngⅡ诱导的心肌细胞肥大与ECSIT表达的相关性,采用AngⅡ刺激细胞,检测在AngⅡ刺激后心肌细胞的肥大程度及细胞内ECSIT表达的变化。为了明确ECSIT在AngII诱导心肌细胞肥大中的作用及其机制,采用ECSIT小干扰RNA(siEC)转染心肌细胞,并于转染48 h或72 h后给予AngⅡ刺激心肌细胞,实验分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siNC组和AngⅡ+siEC组,检测心肌细胞中ECSIT表达变化及心肌细胞肥大程度的改变。通过分析ECSIT与TRAF6的结合情况、ECSIT的泛素化修饰变化及NF-κB结合活性和MAPK信号的变化,进行相关机制的研究。3.检测指标采用超声多普勒检测小鼠主动脉弓缩窄程度;采用超声心动图、称量计算HW/BW和LVW/TL、WGA染色检测小鼠的心肌肥大程度;采用Western Blot和qRT-PCR检测心肌组织和细胞中ECSIT的表达变化;采用qRT-PCR检测心肌组织和细胞中肥大指标ANP、BNP和β-MHC的表达;采用α-actinin免疫荧光染色检测心肌细胞横截面面积,评价心肌细胞肥大程度;采用免疫共沉淀检测ECSIT与TRAF6的结合情况及ECSIT的泛素化修饰;采用EMSA(electrophoretic mobility shift assay,电泳迁移率转变试验)检测NF-κB结合活性,采用Westem Blot检测MAPK家族p38、ERK1/2和JNK的磷酸化激活情况。结果1.ECSIT表达与压力过负荷诱导的心肌肥大的发生发展密切相关TAC术后2周,取小鼠的心脏发现其外观体积明显增大,HW/BW和LVW/TL显著增高;肥大指标ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达亦有显著增加;WGA染色结果表明心肌细胞横截面积明显增大,提示心肌肥大的模型复制成功。同时,超声心动图检测的结果显示,与假手术组小鼠相比,TAC小鼠的IVSd、LVIDd和LVPWd显著增高,EF%和FS%显著降低,提示小鼠发生心肌肥厚并伴随着一定程度的心功能下降。与同周龄的假手术组小鼠相比,TAC组小鼠心肌组织中的ECSIT蛋白和mRNA表达明显增加,提示ECSIT与TAC诱导的心肌肥大发生发展具有相关性。2.ECSIT表达与AngⅡ诱导的心肌细胞肥大密切相关AngⅡ刺激体外原代心肌细胞24 h后,qRT-PCR的检测结果表明,与对照组相比,AngⅡ刺激可诱导心肌细胞ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达的增加,提示AngⅡ可诱导心肌细胞发生肥大。同时,AngⅡ刺激可诱导心肌细胞ECSIT蛋白和mRNA表达的增加,表明心肌细胞肥大可能与ECSIT表达增高具有一定关联性。3.抑制ECSIT的表达可减轻TAC诱导的心肌肥大小鼠转染敲低ECSIT的AAV9-shEC 4周后进行TAC手术。TAC术后2周,荧光表达和蛋白检测表明转染AAV9-shEC后小鼠心肌组织内ECSIT表达显著降低。取小鼠的心脏发现其外观体积与TAC组相比明显减小,HW/BW和LVW/TL显著降低;WGA染色表明心肌细胞横截面积明显减少;超声心动图检测结果显示,转染转染AAV9-shEC抑制ECSIT表达之后,由TAC诱导的小鼠IVSd、LVIDd和LVPWd的增高,EF%和FS%的降低得到了一定程度的逆转。以上研究提示抑制ECSIT的表达可显著改善压力过负荷诱导的心肌肥大。4.抑制ECSIT的表达可减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大心肌细胞转染敲低ECSIT表达的siEC 48 h或72 h后给予AngⅡ刺激。实验发现,转染siEC可明显抑制AngⅡ所诱导的心肌细胞内ECSIT蛋白和mRNA表达的增加。qRT-PCR的检测结果表明,与AngII刺激组相比,肥大指标ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达在抑制ECSIT表达后显著降低。α-actinin免疫荧光染色的结果表明转染siEC敲低ECSIT表达可抑制AngⅡ所致的心肌细胞横截面积的增加,说明敲低ECSIT表达可减轻AngⅡ所诱导的心肌细胞肥大。为了探讨ECSIT蛋白调控AngⅡ诱导心肌细胞肥大的机制,进一步通过免疫共沉淀分别检测了 ECSIT与TRAF6结合及ECSIT的泛素化修饰的变化。Ang II刺激心肌细胞后,细胞内ECSIT与TRAF6的结合显著增加,下游的ECSIT的泛素化水平显著增加;转染siEC敲低ECSIT可抑制Ang II所诱导的ECSIT与TRAF6结合及ECSIT泛素化水平的增加。NF-κB结合活性的检测显示,Ang II刺激诱导的NF-κB结合活性的增加在敲低ECSIT表达后显著降低。同时,Ang II刺激诱导的p38、ERKI/2和JNK磷酸化水平的增加在抑制了 ECSIT的表达后也被显著改善。结论综上所述,ECSIT蛋白在压力过负荷所致的心肌肥大及AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的发生发展中具有重要作用。ECSIT调控AngⅡ所致心肌细胞肥大的机制,与ECSIT和TRAF6的结合及ECSIT泛素化修饰变化,进而影响NF-κB结合活性和MAPK信号的磷酸化激活相关。