荧光各向异性法在临床医学及生化分析领域的应用日益广泛。当溶液的温度和粘度一定时,荧光各向异性值与荧光标记分子的旋转运动和质量体积直接相关。由于大多数分子的质量体积较小,难以产生显著的荧光各向异性变化,因此检测灵敏度有待提高。迄今为止,各种传统的荧光各向异性放大材料如无机纳米材料、生物大分子等被成功用于分析检测。然而,这些荧光各向异性放大策略还存在一定的局限性。一方面,大多数已报道的增强荧光各向异性的无机纳米材料的吸收在可见光区,能与常用染料的荧光发射光谱重叠,通过荧光共振能量转移使荧光猝灭,导致荧光各向异性测量值大于0.4,此时,可推断出除了荧光外还存在散射光,使检测准确度降低。另一方面,尽管生物大分子作为荧光各向异性放大材料可克服荧光猝灭的缺点,但是一个生物大分子的质量和体积有限,放大荧光各向异性的能力有限,使检测灵敏度受到限制。鉴于此,本论文设计了无荧光猝灭的生物大分子组装体放大荧光各向异性的新方法,并结合核酸信号放大策略,实现了一系列生物分子的分析检测。具体研究内容包括以下三个方面:(1)为了保证荧光各向异性放大材料在对荧光无猝灭以提高检测准确度的前提下,克服一个生物大分子放大荧光各向异性能力有限导致灵敏度降低的缺点,我们利用DNA循环(催化发卡组装,CHA)诱导多个蛋白质形成组装体增强荧光各向异性,建立了准确灵敏的通用检测方法。在本方法中,靶物的核酸适配体固定在磁珠(MBs)上并与催化链杂交,加入靶物后,靶物与核酸适配体的强结合作用使催化链从MBs上释放。经磁分离后,游离的催化链能引发CHA反应(CHA系统包含两个修饰有生物素的发卡,其中一个作为探针DNA修饰有荧光团),生成带有生物素和荧光团的DNA双链。在链霉亲和素(SA)的存在下,SA与DNA双链上生物素结合使多个SA聚集形成蛋白质组装体,导致荧光各向异性值增加。当不存在靶物时,CHA无法发生,每个荧光探针只能与一个SA结合,因此荧光各向异性值较低。通过增加的荧光各向异性值实现了miRNA-145、ATP和葡萄球菌B型肠毒素(SEB)的准确灵敏检测,并且成功用于了复杂样品中SEB的灵敏检测,说明该方法具有通用性,通过改变相应的核酸适配体序列还可实现其他靶物的检测。本方法主要存在以下优点:一方面,由于蛋白质组装体不猝灭荧光,极大地提高了检测准确度;另一方面,由多个蛋白质形成的组装体具有优异的荧光各向异性增强能力,提升了检测灵敏度。(2)在上述方法中,未加靶物时,探针与SA相连导致空白条件下荧光各向异性值较高。因此,为了降低背景值,我们借助DNA树状组装体放大荧光各向异性,构建了准确、灵敏的miRNA-21检测方法。在本设计中,利用杂交链式反应和生物素与SA之间的亲和性合成了具有大质量的DNA树状组装体,荧光探针DNA通过连接DNA固定在DNA树状组装体中,荧光分子的旋转运动受到限制,导致荧光各向异性值增大。加入miRNA-21后,通过引发CHA过程,使靶物循环。同时,生成的双链体与探针DNA形成复合物,使其从DNA树状组装体上释放,导致荧光各向异性值降低。通过降低的荧光各向异性信号实现了miRNA-21的准确灵敏检测。荧光各向异性变化值与mi RNA-21浓度在1 nM-19nM间呈现良好的线性关系,检测限为52 pM。该方法利用DNA树状组装体较大的分子质量和无荧光猝灭的特性,提高了检测准确度和灵敏度;在空白条件下,单链探针DNA具有较小的荧光各向异性值,使背景值极大地降低,进一步提高了检测灵敏度。(3)在上述两种方法中,尽管克服了荧光猝灭导致的准确度降低的问题,但是生物大分子组装体的尺寸不可控,连接探针的数量不可控,使精密度受到了限制。为了解决上述问题,我们构建了无荧光猝灭且尺寸可控的二维DNA纳米片增强荧光各向异性的简单通用策略。在本设计中,探针DNA通过手柄DNA间接固定在DNA纳米片的表面,由于分子量的增加及荧光团的旋转运动受到限制,从而引起荧光各向异性信号的显著增强。加入靶物后,探针DNA从DNA纳米片上释放,使荧光各向异性值减小。通过测定加入靶物前后荧光各向异性值的变化实现了对单链DNA、三磷酸腺苷(ATP)和凝血酶的准确灵敏检测。本方法具有以下优点:首先,DNA纳米片的无荧光猝灭效应保证了检测准确度;其次,DNA纳米片的尺寸可控,连接探针的数量可控的性质使检测精密度提高。综上所述,在本研究中,我们提出了生物大分子组装体(蛋白组装体、核酸组装体)增强荧光各向异性策略,并将其成功应用到一系列生物分子(核酸、蛋白质、ATP)的分析检测中。通过多个生物大分子形成拥有大质量和体积的组装体用于增强荧光各向异性信号,使检测灵敏度提高;通过生物大分子组装体对荧光无猝灭的性质,使检测准确度提高。此外,这些方法具有一定的通用性,可以通过调整相应的识别序列来检测其他靶物。